多杀菌素对天敌昆虫白蛾周氏啮小蜂的毒力评估

刘飞雨，任怡静，金 欣，郭美琪，李 敏，潘丽娜*

1天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2天津师范大学天津市动物多样性保护与利用重点实验室，天津 300387

美国白蛾Hyphantriacunea(Drury)属鳞翅目灯蛾科，是入侵性、国际性检疫害虫，主要通过幼虫取食叶片危害林木、果树、花卉及园艺作物，给我国农林生产带来重大经济损失(卢修亮等，2020)。目前在美国白蛾集中暴发区，主要采用航空施药防治为主，地面防治为辅的防治策略，可基本控制美国白蛾疫情，但化学农药会带来一系列环境、生态、食品安全问题等。探索无公害、长效的防治技术对于美国白蛾的可持续防控有重要意义。白蛾周氏啮小蜂Chouioiacunea(Yang)是杨忠岐(2018)发现的一种对美国白蛾有显著防治效果的蛹寄生蜂，其寄生率可达92.2%。化学防治与生物防治相结合是害虫综合防治的重要策略，而常见杀虫剂对白蛾周氏啮小蜂的安全性评价甚少。

多杀菌素是具有杀虫效应的土壤细菌刺糖多孢菌Saccharopolysporaspinosa有氧发酵的次级代谢产物，相对于有机磷杀虫剂，多杀菌素是一种低毒、对环境友好的广谱杀虫剂(Galm & Sparks，2015；Kirst，2010)，对于多种农业害虫有良好的杀虫效应(Morales-olaisetal.，2020)。与高效氯氟氰菊酯、氯虫苯甲酰胺等常用杀虫剂类似，多杀菌素施药后会长时间存留在植物叶片上，且对天敌昆虫如捕食性天敌齿爪盲蝽Deraeocorisbrevis、寄生性天敌玉米螟卵赤眼蜂TrichogrammachilonisIshii有明显的触杀效应，同时显著影响寄生天敌的寄生性(Amarasekare & Shearer,2020; Khan,2019)。

多杀菌素可通过体表渗透进入昆虫体内，且一旦进入将无法代谢排出。多杀菌素的杀虫效应主要是通过变构拮抗烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR，一种经递质配体门控的离子通道蛋白)，刺激昆虫神经系统，导致非功能性肌肉收缩、震颤、麻痹而死亡(Sparksetal.，2012)。在田间及实验室筛选获得的抗性害虫品系多发生nAChR alpha6蛋白失活。应用CRISPER技术敲除2个nAChR 亚基(Haalpha6和Haalpha7)发现，与对照相比，敲除Haalpha6的棉铃虫HelicoverpaarmigeraHubner及小菜蛾Plutellaxylostella(Linnaeus)对多杀菌素的抗性均显著提高(Wangetal.,2020a，2020b)。

评估杀虫剂对天敌昆虫的风险程度，可为制定综合害虫防治和保护天敌昆虫的措施提供理论基础。因此，本研究采用药膜法，通过不同浓度多杀菌素处理，检测其对美国白蛾寄生性天敌周氏啮小蜂的安全性，并以亚致死浓度多杀菌素胁迫刺激白蛾周氏啮小蜂，测定其谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase, GSTs)、羧酸酯酶(carboxyesterase, CarE)2种主要解毒酶及乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AchE)的活性，旨在为全面阐明白蛾周氏啮小蜂对多杀菌素的解毒机制、白蛾周氏啮小蜂的抗药性及综合防控美国白蛾提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试昆虫 白蛾周氏啮小蜂由漯河市豫中南林业有害生物天敌繁育研究中心惠赠，在本实验室传代培养。培养条件：人工气候箱(PQX-350H)温度25 ℃，相对湿度75%，光周期13L∶11D。自接种于柞蚕(AntheraeapernyiGuerin-Meneville)蛹后，培养14 d获得老熟幼虫，培养20 d获得成虫。

1.1.2 药剂及仪器 乙基多杀菌素悬浮剂(有效成分含量3%)，美国陶氏益农公司(田间使用浓度24～40 mg·L-1)。AchE活性测定试剂盒(货号：BC2025)、GSTs活性检测试剂盒(货号：BC0355)、CarE活性检测试剂盒(货号：BC0840)，北京索莱宝科技有限公司。手持式电动组织研磨器，上海净信实业发展有限责任公司。多功能酶标仪(Infinite 200)，瑞士帝肯(Tecan)。

1.2 方法

1.2.1 室内毒力评估及安全性评价 室内毒力评估采用药膜法，将60 g·L-1多杀菌素用清水稀释，配制成有效浓度为0、5、10、15、20、25 mg·L-1的药液。在干净的50 mL广口锥形瓶中倒满药液，静置5 min，倒出管内药液，自然晾干，使药液在管壁上均匀形成药膜，接入羽化后12 h内成蜂50头，瓶口用120目网布封紧，分别于1、2、4、6和24 h后检查统计瓶中白蛾周氏啮小蜂死亡数量。初步确定多杀菌素对白蛾周氏啮小蜂的毒力，并计算多杀菌素使白蛾周氏啮小蜂死亡10%、20%、30%、50%的剂量(LC10、LC20、LC30、LC50)。

农药对白蛾周氏啮小蜂的毒性评价目前国内外尚无统一的标准，白蛾周氏啮小蜂与赤眼蜂Trichogrammatidspp.同为寄生性天敌昆虫，可参照赤眼蜂进行安全性评价。根据《化学农药环境安全评价试验准则》(中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局等，2014)，赤眼蜂的安全性评价采用安全系数法：极高风险(安全系数≤0.05)；高风险(0.05<安全系数≤0.5)；中风险(0.5<安全系数≤5)；低风险(安全系数>5)。因此，多杀菌素的安全系数为白蛾周氏啮小蜂的半致死浓度LC50与该药的田间推荐施用浓度的比值，即：安全系数=毒性LC50/田间实际使用浓度。

1.2.2 酶活性测定 分别取不同亚致死浓度0、LC10(5.6 mg·L-1)、LC20(7.3 mg·L-1)、LC30(8.8 mg·L-1)、LC50(11.9 mg·L-1)处理后存活的幼虫进行相关酶活性的测定。取白蛾周氏啮小蜂150只(约0.025 g)，根据试剂盒推荐比例加入试剂，冰浴中整体研磨匀浆，匀浆液12000 r·min-1、4 ℃离心15 min，取上清液作为CarE、GSTs和AchE活性测定的酶源。CarE、GSTs和AchE活性测定参照检测试剂盒说明书，每处理3次重复。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0软件计算毒力回归方程和致死中浓度，采用Excel 2016对酶活力测定结果进行统计分析并作图。

2 结果与分析

2.1 多杀菌素对白蛾周氏啮小蜂的毒力评估及安全性评价

多杀菌素对白蛾周氏啮小蜂无短期(1 h)触杀作用，但随施药时间延长，其对小蜂的毒杀作用增强，25 mg·L-1多杀菌素施药2 h后，可诱导18.67%小蜂个体死亡。施药4 h后，不同浓度多杀菌素对小蜂的毒杀作用差异最明显，低浓度(5 mg·L-1)多杀菌素可诱导11.33%小蜂死亡，而中、高浓度多杀菌素(≥15 mg·L-1)可诱导77.33%～88.00%个体死亡。施药6 h后，高浓度多杀菌素(≥20 mg·L-1)可造成几乎全部个体死亡。施药24 h后，各施药浓度均可引起超过96.00%的小蜂死亡，说明多杀菌素对白蛾周氏啮小蜂有显著毒杀作用(表1)。

表1 不同浓度多杀菌素处理后白蛾周氏啮小蜂成蜂存活率

进一步触杀毒力分析表明，施药2 h，LC50值为52.70 mg·L-1，依据田间使用浓度24 mg·L-1计算，安全系数为2.20，属中风险性农药。而施药4和6 h后，LC50值分别为12.06和7.44 mg·L-1，安全系数为0.50和0.31，属高风险性农药(表2)。说明虽然多杀菌素对白蛾周氏啮小蜂触杀作用不强，但仍具明显毒杀作用，属于高风险性农药，在白蛾周氏啮小蜂生防区域需慎用。

表2 多杀菌素对白蛾周氏啮小蜂成蜂的触杀毒力

2.2 多杀菌素胁迫对白蛾周氏啮小蜂酶活性的影响

2.2.1 多杀菌素胁迫对白蛾周氏啮小蜂AchE活性的影响 多杀菌素通过拮抗烟碱型乙酰胆碱受体，作用于昆虫的神经系统，从而对鳞翅目、缨翅目和双翅目害虫具有良好的防治作用(王燕燕等，2015)。本研究结果发现，伴随多杀菌素浓度提高，白蛾周氏啮小蜂AchE活性无明显变化，当多杀菌素浓度为LC50时，AchE活性为1.3 U·mg-1，白蛾周氏啮小蜂AchE活性仅可达对照的1.3倍，即高浓度多杀菌素处理会引起AchE活性提高，但无法形成其对药物的抗性作用(图1)。

2.2.2 多杀菌素胁迫对白蛾周氏啮小蜂GSTs、CarE活性的影响 本研究对白蛾周氏啮小蜂2种解毒酶(GSTs及CarE)活性变化的研究结果发现，多杀菌素对白蛾周氏啮小蜂GSTs活性诱导作用呈剂量效应。随着多杀菌素浓度的升高，GSTs活性变化由缓慢到显著上升，在高浓度(11.9mg·L-1)时活性被显著诱导，说明GSTs主要在高浓度多杀菌素的解毒代谢中发挥重要作用。各亚致死浓度的多杀菌素处理对CarE活性均有显著的诱导作用，高浓度(11.9 mg·L-1)时CarE活性为4.5 U·mg-1，诱导作用达到最强，说明多杀菌素在试验范围内均能显著增强CarE活性，CarE在白蛾周氏啮小蜂解毒机制中发挥重要作用(图1)。

图1 多杀菌素胁迫对白蛾周氏啮小蜂AchE、GSTs和CarE活性的影响

3 讨论

在化学防治中，杀虫剂亚致死效应对捕食性天敌的抗药性研究具有重要意义。捕食性天敌的抗药性机理主要有2种：靶标酶敏感性降低和解毒酶活性升高(杨慧等,2020)。研究表明，棉铃虫的GSTs与有机磷-毒死蜱、敌敌畏和拟除虫菊酯-氯氰菊酯供试农药具有较强的亲和力，其体内的GSTs活性和基因表达的上调具有剂量效应，且GSTs和酯酶的解毒机制参与了杀虫剂抗性的产生(Wangetal.，2016)，促进了昆虫对有害物质的解毒代谢(Labadeetal.,2018)。水解酶类羧酸酯酶的解毒代谢能力增强是抗药性产生的重要机制，研究表明棉蚜AphisgossypiiGlover的羧酸酯酶活性的变化与抗药性程度呈正相关关系(卢芙萍等，2006)。本研究中，CarE的活性随着供试药剂浓度的增加而上升，推测白蛾周氏啮小蜂中CarE与抗药性程度相关，CarE可能是诱发白蛾周氏啮小蜂对多杀菌素产生抗药性的一个潜在因素。靶标酶AchE的敏感性变化与昆虫的抗药性产生密切相关，多杀菌素类杀虫剂作用靶标烟碱型乙酰胆碱受体，使昆虫体内的AchE快速水解兴奋型神经递质乙酰胆碱，阻碍其神经递质在突触间的传递进而影响神经冲动的产生，最终导致昆虫出现异常肌肉兴奋甚至中毒死亡(孟琳琳等,2010)。研究表明，草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda(J.E Smith)体内AchE的活性随乙基多杀菌素剂量的增加而增加，对虫体产生其抗药性起着重要作用(高祖鹏等,2020)。本研究中，AchE的活性与供试药剂存在剂量效应，在高浓度AchE活性较高，推测其在高浓度药剂下发挥显著作用，增强抗药性的产生。

本研究表明，多杀菌素对白蛾周氏啮小蜂存在一定的毒害作用，且施药时间较短时多杀菌素对白蛾周氏啮小蜂具有中风险性，施药时间较长时有高风险性。推测利用多杀菌素防治美国白蛾会对白蛾周氏啮小蜂具有显著的触杀作用，因此，在使用多杀菌素防治美国白蛾时，应注意保护白蛾周氏啮小蜂。