曲安奈德对自发性高血压大鼠视网膜P2X7R/NLRP3通路及眼底血管病变的影响△

田甜 吴凌 徐丽

高血压是心脑血管疾病的主要危险因素，可导致动脉粥样硬化、心脑疾病、肾脏疾病、眼底视网膜病变等多种并发症，并可导致患者猝死[1-2]。眼底血管病变是高血压主要并发症之一，也是成人致盲的主要原因之一，70%高血压患者有不同程度的视网膜病变，眼底视网膜病变可反映机体动脉情况，对判断高血压严重程度及预后有较高的临床价值[3-4]。嘌呤能2X7受体(purinergic 2X7 receptor，P2X7R)/核苷酸结合寡聚化结构域受体蛋白3(nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)通路参与机体组织细胞的炎症反应，减少炎症因子的产生，从而减轻病理因素对组织细胞损伤的作用[5-6]。曲安奈德(triamci-nolone acetonide，TA)是一种人工合成的皮质类固醇类化学药物，主要药理作用是抗炎和免疫抑制[7-8]。有研究表明，TA可用来改善视网膜黄斑变性及眼底病变[9-10]。但TA对高血压视网膜病变过程中P2X7R/NLRP3通路的调控作用及对眼底血管病变影响未见报道，本文对此进行探讨，为临床合理用药提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物清洁级10周龄自发性高血压(spontaneously hypertensive，SHR)京都维斯特(Wistar-kyoto，WKY)雄性大鼠40只和同源、同性别、同周龄且血压正常的WKY大鼠10只，均由本院实验动物中心提供。所有大鼠于本院动物房中饲养，饲养条件：自然光照，自由饮食、饮水，温度25 ℃，相对湿度50%，保持动物房环境及鼠笼清洁、透气。本研究经我院动物伦理委员会批准同意。

1.1.2 主要试剂及仪器TA(北京凯瑞基生物有限公司，每瓶100 mg)；HE染色试剂盒(碧云天生物技术研究所)；BCA蛋白定量试剂盒和胰蛋白酶均购自美国Pierce公司；P2X7R抗体(上海煊翎生物科技有限公司)；NLRP3抗体(武汉菲恩生物科技有限公司)；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抗体、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)抗体(武汉益普生物科技有限公司)；蛋白电泳仪、半干转膜仪(型号1659001、Trans-Blot SD，美国Bio-Rad公司)；BIOPAC多导(16道)生理记录仪(北京普升达科贸有限公司)；生命信息处理系统(Powerlab 系统)[德仪器国际贸易(上海)有限公司]；大鼠用无创伤血压测量仪(we1548，北京智鼠多宝生物科技有限责任公司)；S360裂隙灯显微镜、迈瑞Mindray彩色多普勒超声仪(上海涵飞医疗器械有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及给药用裂隙灯显微镜检测并挑选出双眼均有视网膜病变的SHR大鼠40只，随机分为模型组(SHR组)、TA低剂量组(20 g·L-1)、TA中剂量组(40 g·L-1)和TA高剂量组(80 g·L-1)，每组10只，同时将10只健康无高血压的WKY大鼠作为空白组(Control组)。各组适应性喂养1周后，TA低、中、高剂量组均在角膜外3点钟位、6点钟位、9点钟位和12点钟位四个方向的角膜缘后1.0 mm处球结膜下分别注射10 μL相应剂量的TA[11]，Control组和SHR组在相同部位注射等体积生理盐水，各组每隔7 d注射一次，共给药2周。

1.2.2 各组大鼠血压及眼压检测各组大鼠给药2周后用无创伤血压测量仪联合16道生理记录仪和生命信息处理系统经鼠尾测定血压。用眼压计检测大鼠左眼眼压，读取3次眼压值，取平均值。

1.2.3 各组大鼠眼底视网膜组织形态观察各组大鼠给药2周后，将鼠眼散瞳后在黑暗中适应30 min，用裂隙灯显微镜观察各组大鼠眼底病变情况及视网膜动静脉形态。

1.2.4 各组大鼠视网膜血流动力学指标检测各组大鼠在完成眼底检查后，用彩色多普勒超声仪检测左眼血流动力学指标：视网膜中央动脉(central retinal artery，CRA)血流速度和视网膜中央静脉(central retinal vein，CRV)血流速度。

1.2.5 各组大鼠视网膜毛细血管密度及毛细血管形态检测各组大鼠在完成血流动力学指标检测后，麻醉处死大鼠，摘除双眼眼球，左眼进行视网膜分离，用组织匀浆器均浆，离心分离后提取蛋白，于-20 ℃冰箱中保存，以备后续实验。右眼眼球置于40 g·L-1多聚甲醛中4 ℃固定24 h后钝性分离视网膜组织，加入1 mL的0.1 mol·L-1三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(Tris-HCL)及30 g·L-1胰蛋白酶消化液，室温孵育3 h后置于玻片上进行常规HE染色。消化铺片干燥后，置于显微镜下观察组织形态变化，每只大鼠随机取5张图像，用Image proplus 6.0 软件测定视网膜毛细血管密度。毛细血管密度(%)=毛细血管总面积/视网膜总面积×100%。

1.2.6 Western blot检测视网膜组织P2X7、NLRP3、TNF-α、IL-6蛋白表达取保存的视网膜蛋白提取液，4 ℃下解冻后按BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度，取200 μg蛋白进行十二烷基酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，接着将全部蛋白转移至硝酸纤维素膜上，并置于50 g·L-1脱脂奶粉溶液中，于摇床上37 ℃封闭2 h，将目的蛋白条带置于孵育盒中，分别加入各种因子抗体(P2X7、NLRP3、TNF-α、IL-6、β-actin，稀释度分别为11000、1100、11000、11000、12000)于 4 ℃冰箱中孵育过夜，经TBST漂洗3次，加入稀释度11000的羊抗兔二抗溶液，于摇床上室温孵育2 h，经TBST再次漂洗3次，采用增强化学发光法显色，以凝胶成像仪观察条带并拍照，并利用Image J软件分析各组视网膜中不同因子蛋白的相对表达。

2 结果

2.1 各组大鼠血压及眼压比较与Control组相比，SHR组大鼠收缩压、舒张压、平均血压、眼压均升高(均为P<0.05)；与SHR组相比，TA低、中、高剂量组收缩压、舒张压、平均血压、眼压均无明显变化(均为P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血压、眼压比较

2.2 各组大鼠眼底病变情况Control组大鼠眼底结构正常。与Control组相比，SHR组大鼠视网膜动脉变细，管径不规则，静脉扩张迂曲，视网膜水肿，且有血液渗出及黄斑部渗出性病灶。TA低、中、高剂量组视网膜水肿减轻，棉绒状斑块、硬性渗出、出血及广泛微血管改变减弱，血管壁收缩变窄情况好转，同时血液渗出及黄斑部的黄灰色渗出性病灶减少。各组大鼠眼底检查结果见图1。

2.3 各组大鼠血流动力学指标比较与Control组相比，SHR组大鼠CRA、CRV血流速度均降低(均为P<0.05)；与SHR组相比，TA低、中、高剂量组CRA、CRV血流速度均升高(均为P<0.05)，且各剂量组CRA、CRV血流速度呈剂量依赖性升高(见表2)。

图1 各组大鼠眼底检查结果 A：Control组；B：SHR组；C：TA低剂量组；D：TA中剂量组；E：TA高剂量组

表2 各组大鼠CRA、CRV血流速度比较

2.4 各组大鼠视网膜血管形态及毛细血管密度比较Control组大鼠视网膜毛细血管管径粗细一致，内皮细胞正常。与Control组[毛细血管密度(0.53±0.05)%]相比，SHR组大鼠视网膜可见毛细血管闭塞呈细线状,毛细血管周细胞及内皮细胞减少、闭锁，且毛细血管密度(0.28±0.04)%明显降低(P<0.05)。与SHR组相比，TA低、中、高剂量组毛细血管闭塞、周细胞及内皮细胞减少、闭锁现象均有不同程度改善，毛细血管密度明显升高(P<0.05)，TA低、中、高剂量组毛细血管密度分别为(0.33±0.04)%、(0.41±0.06)%、(0.46±0.04)%，呈剂量依赖性(见图2)。

图2 各组大鼠视网膜血管形态检测结果(HE染色，×400) A：Control组；B：SHR组；C：TA低剂量组；D：TA中剂量组；E：TA高剂量组

2.5 各组大鼠视网膜组织P2X7、NLRP3、TNF-α、IL-6蛋白相对表达水平与Control组相比，SHR组大鼠视网膜组织P2X7、NLRP3、TNF-α、IL-6蛋白表达水平均明显升高(均为P<0.05)；与SHR组相比，TA低、中、高剂量组P2X7、NLRP3、TNF-α、IL-6蛋白表达水平均明显降低(均为P<0.05)，且TA各剂量组上述指标呈剂量依赖性降低(见表3和图3)。

表3 各组大鼠视网膜组织P2X7、NLRP3、TNF-α、IL-6蛋白表达水平

图3 各组大鼠视网膜组织P2X7、NLRP3、TNF-α、IL-6的蛋白表达 A：Control组；B：SHR组；C：TA低剂量组；D：TA中剂量组；E：TA高剂量组

3 讨论

高血压性视网膜病变是由高血压引起的常见微血管病变并发症，因血压持续升高而造成视网膜静脉阻塞、血-视网膜屏障破坏、血浆及血管内成分渗出，导致视网膜水肿、出血、缺血或眼底出现棉絮状斑、硬性渗出等病变，严重者可出现视网膜脱离，最终导致患者失明[12]。

TA是一种长效糖皮质激素，被广泛应用于玻璃体视网膜病变、视网膜黄斑水肿、视网膜毒性反应、视网膜脱离、视网膜出血等多种眼科疾病的治疗[13]。刘明月[14]发现，TA可减轻血-视网膜屏障的破坏，促进渗出吸收，治疗视网膜静脉阻塞引起的眼底黄斑水肿等病变；周琰倢等[15]发现，TA可减少黄斑前膜或黄斑裂孔玻璃体切割手术中的出血量。我们推测，TA也可改善高血压性视网膜血管病变症状，并建立SHR大鼠模型对此进行验证发现，与Control组相比，SHR组大鼠收缩压、舒张压、平均血压、眼压均升高，裂隙灯眼底检查可见眼底动静脉血管变细，部分出现黄斑水肿、渗血等现象，彩色多普勒成像显示视网膜血流动力学指标CRA、CRV的血流速度均明显较少，HE染色显示部分毛细血管闭塞、消失及密度减少，提示SHR大鼠视网膜出现动静脉变细、血流减少及毛细血管闭塞等病变。而眼底局部给予TA低、中、高剂量治疗后发现，与SHR组相比，TA各剂量组大鼠眼底黄斑水肿、出血明显减少，视网膜血流动力学指标CRA、CRV血流速度增高，毛细血管闭塞减少，毛细管密度增多，且TA各剂量组呈剂量依赖性，而TA各剂量组收缩压、舒张压、平均血压、眼压略有升高，但升高不明显，表明TA可增加SHR大鼠CRA、CRV血流速度和毛细血管密度，改善视网膜动静脉血管变细、毛细血管闭塞痉挛等病变，减少视网膜黄斑水肿、出血等症状，而TA外用短期内对大鼠血压和眼压升高不明显。

延缓和逆转高血压性视网膜病变是高血压患者治疗过程中的重要策略，近年来大量研究表明，炎症因子参与高血压性视网膜病变过程[16-17]。陶丽妃等[18]发现，脂联素可抑制促炎因子和血管生长因子释放，进而干预高血压性视网膜血管病变；Kiang等[19]发现，炎症因子IL-6 可诱导眼底VEGF释放来促进视网膜病变的程度，TNF-α可破坏血-视网膜屏障，促进视网膜病变的发展。而P2X7/NLRP3通路参与机体炎症反应[5-6]，石蕊等[20]发现,非诺贝特可通过下调糖尿病小鼠视网膜病变组织中P2X7/NLRP3通路蛋白表达，发挥视网膜保护作用；李婷等[16]发现,非诺贝特可抑制炎症因子IL-6、TNF-α释放，改善高血压性视网膜病变。本研究发现，与Control组相比，SHR组大鼠视网膜组织P2X7、NLRP3、IL-6、TNF-α蛋白表达均增高，提示高血压性视网膜病变组织P2X7/NLRP3通路蛋白表达增高，炎症因子释放增多。而与SHR组相比，TA高、中、低剂量组大鼠视网膜组织P2X7、NLRP3、IL-6、TNF-α蛋白表达均降低，且呈剂量依赖性，表明TA对高血压性视网膜血管病变的改善作用可能是通过抑制P2X7/NLRP3通路蛋白表达和炎症因子释放实现的。

综上所述，TA可抑制P2X7/NLRP3通路蛋白表达和炎症因子释放，增加CRA、CRV的血流速度和毛细血管密度，改善高血压所致视网膜眼底病变,为临床治疗高血压性视网膜眼底病变提供了一定的参考。但本研究也存在一定的不足，高血压性视网膜眼底病变机制复杂，TA虽可缓解视网膜病变症状，但对血压和眼压作用变化不大，TA外用并佐以降压药物内服治疗高血压性视网膜病变效果将会更好，本研究未对TA+降压药物联合治疗高血压性视网膜病变进行研究，这有待后续继续研究。