玉米穗腐病致病禾谷镰孢复合种的遗传多样性、致病力与毒素化学型分析

王宝宝，郭成，孙素丽，夏玉生，朱振东，段灿星

玉米穗腐病致病禾谷镰孢复合种的遗传多样性、致病力与毒素化学型分析

王宝宝1，郭成2，孙素丽1，夏玉生1，朱振东1，段灿星1

（1中国农业科学院作物科学研究所/国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程，北京 100081；2甘肃省农业科学院植物保护研究所，兰州 730070）

【】明确中国玉米穗腐病致病禾谷镰孢复合种（species complex，FGSC）的菌群遗传结构、致病力、毒素化学型及其相互关系，为玉米镰孢穗腐病防控提供参考信息。从中国玉米主产区采集玉米穗腐病样本，经单孢分离鉴定，选取代表性的禾谷镰孢复合种，利用22对SSR和10对VNTR引物，使用Popgen32、NTsys2.1、STRUCTURE2.3.4群体遗传学研究软件进行数据分析，结合、-和基因测序构建系统发育树，分析7个地理区域禾谷镰孢复合种的遗传多样性，采用花丝通道注射接种法测定各镰孢菌的致病力，利用产毒基因特异性引物进行毒素化学型的检测。在禾谷镰孢复合种中共检测到等位位点数48个，多态性位点数39个，多态性条带比率为81.25%，每对引物扩增出多态性条带2—4条；禾谷镰孢复合种7个地理群体平均Shannon’s信息指数和Nei’s遗传多样性指数分别为0.41和0.29，7个地理区域遗传相似度集中在0.6677—0.8797，遗传距离为0.1282—0.4039，表明菌群间具有较丰富的遗传多样性。依据Nei’s遗传距离对7个地理种群进行UPGMA聚类分析，可划分为3个类群；STRUCTURE2.3.4群体结构分析表明，禾谷镰孢复合种菌群被分为2个大类群最合适，西北地区绝大部分属于类群A，华中地区和华南地区菌株均属于类群B，东北地区50%以上菌株属于类群B。、-和基因序列分析表明禾谷镰孢复合种由禾谷镰孢（）、亚洲镰孢（）、布氏镰孢（）和南方镰孢（）构成，上述镰孢菌中存在142个单核苷酸多态性位点（SNP），通过这些差异序列构建的聚类图能清楚显示出各个种内与种间的遗传分化情况，各镰孢种内遗传多样性十分丰富。禾谷镰孢致病力最强，平均发病面积百分比为20.79%；亚洲镰孢、布氏镰孢和南方镰孢的平均发病面积百分比分别为15.79%、11.77% 和 8.12%。统计分析表明，不同镰孢种所引起的穗腐病平均发病面积占比存在显著差异。禾谷镰孢毒素化学型为15ADON、3ADON、NIV和3ADON+15ADON+NIV 4种，以15ADON为主；布氏镰孢毒素化学型为15ADON、3ADON、NIV、3ADON+15ADON和3ADON+15ADON+NIV 5种，以15ADON为主；亚洲镰孢毒素化学型只有3ADON；南方镰孢毒素化学型为15ADON、3ADON、15ADON+NIV 3种，15ADON为优势类型。此外，15ADON、NIV和3ADON毒素类型菌株平均发病面积百分比分别为17.87%、17.20%和12.37%。我国不同地理区域尤其是相邻区域禾谷镰孢复合种菌群间存在较为频繁的基因交流与交换。本研究中禾谷镰孢复合种的主要毒素化学型为15ADON，致病力由强到弱依次为禾谷镰孢＞亚洲镰孢＞布氏镰孢＞南方镰孢。整体看来，毒素化学型与菌种类型相关性不显著，致病力主要与菌种类型有关。

玉米穗腐病；禾谷镰孢复合种；遗传多样性；毒素化学型；致病力

0 引言

【研究意义】玉米是我国重要的粮食作物、饲料作物和能源植物，而穗腐病是玉米生产上最为重要的病害之一，严重影响玉米的产量和品质[1]。我国玉米穗腐病致病菌复杂多样，真菌和细菌均可引起穗腐病，在真菌中，尤以禾谷镰孢复合种（species complex，FGSC）和拟轮枝镰孢（）引起的穗腐病分布最广，危害最重[2]。2018年我国玉米产量25 717.4万吨（http://www.stats.gov.cn/tjsj/ndsj/2019/indexch.htm），作为食用和饲用消费占2/3以上。穗腐病致病镰孢菌产生的真菌毒素对玉米籽粒的污染给粮食安全带来极大隐患。因此，对来自中国玉米主产区不同区域的穗腐病致病禾谷镰孢复合种进行遗传多样性、致病力和毒素化学型分析，可为穗腐病的防控提供基础信息，为保障玉米安全生产提供风险警示。【前人研究进展】禾谷镰孢复合种是引起我国玉米穗腐病的优势种[2-6]，其不仅能侵染玉米引起穗腐病、茎腐病、鞘腐病和苗枯病等[7]，还侵染小麦、大豆和水稻等农作物，引起小麦赤霉病[8]、大豆根腐病[9]和水稻赤霉病[10]等重要病害。更重要的是，禾谷镰孢复合种能产生多种有害真菌毒素，例如雪腐镰刀菌烯醇（NIV）、黄色镰刀菌素、玉米赤霉烯酮（ZEN）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及其衍生物15ADON和3ADON[4,11]，严重影响了玉米籽粒的产量和品质，一旦被毒素污染的玉米产品流入市场，进入食物链，将对人畜健康造成严重威胁[12-13]。利用分子标记对植物和病原菌进行遗传多样性分析，已经取得了良好的结果。GAI等[14]利用ISSR分子标记分析了东北地区40株茎腐病和穗腐病禾谷镰孢复合种菌株的遗传多样性和致病力，通过聚类分析，在遗传相似系数为0.62时菌株被分为两组；马红霞等[15]采用ISSR引物分析来自11个省的禾谷镰孢复合种，发现菌株群体内存在丰富的遗传变异，不同地理种群间存在一定的基因交流，遗传多样性与地理来源有关；Yerkovich等[16]采用ISSR分子标记分析了禾谷镰孢复合种遗传多样性（GD=0.999—1.000）；Sneideris等[17]用10对VNTR分子标记分析了57株禾谷镰孢菌株群体，发现较高的遗传多样性；任旭[18]采用VNTR和SSR标记对拟轮枝镰孢和禾谷镰孢复合种的部分菌株进行遗传多样性分析，明确其具有丰富的基因变异，证实了VNTR和SSR标记的实用性；李新凤等[19]依据拟轮枝镰孢的EST序列，开发出25对SSR引物，并证明可用于拟轮枝镰孢及其近缘种的遗传多样性分析。【本研究切入点】目前，在中国报道能引起玉米穗腐病的禾谷镰孢复合种已达10个种（禾谷镰孢、亚洲镰孢、布氏镰孢、南方镰孢、九州镰孢、梨孢镰孢、拟枝孢镰孢、黄色镰孢等）。不同地理区域禾谷镰孢复合种菌群构成、产毒素潜力及致病力、遗传变异等方面差异较大。SSR、VNTR分子标记技术在进行镰孢菌遗传分析上应用广泛且成熟，结合运用、-和基因序列分析禾谷镰孢复合种遗传多样性的研究报道较少，将二者结合，互为补充，更能准确地对镰孢菌进行遗传分化与多样性分析。【拟解决的关键问题】分析我国7个地理区域（华北、华中、华东、东北、华南、西北和西南地区）禾谷镰孢复合种的遗传多样性、致病力和毒素化学型，为玉米穗腐病的综合防控、镰孢菌致病机理相关研究以及玉米品种的抗病鉴定相关工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2014—2018年，在中国13个省（直辖市、自治区）（河北、河南、安徽、山东、陕西、重庆、四川、云南、北京、辽宁、广西、贵州、黑龙江）采集玉米病穗样本，并用组织分离法对采集到的玉米样品进行病原菌分离鉴定[2,5-6]，确定菌种的构成。为分析分离致病菌中禾谷镰孢复合种的遗传多样性，从不同省（直辖市、自治区）选取具代表性的禾谷镰孢复合种45株，根据地理来源将其分为7大类群，分别为华北、华中、华东、东北、华南、西北和西南地区。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：DifcoTMPotato Dextrose Agar 39 g、蒸馏水1.0 L；合成低营养琼脂（spezieller nahrstoffarmer agar，SNA）液体培养基：KH2PO41.0 g、KNO31.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、蔗糖0.2 g、葡萄糖0.2 g、蒸馏水1.0 L。

真菌基因组DNA提取试剂盒（索莱宝科技有限公司，北京）；超微量核酸蛋白测定仪（Q5000，美国QUAWELL公司）；凝胶成像系统（Tanon 4100，南京）；2×TaqPCR Master Mix、100 bp DNA Ladder（天根生化科技有限公司，北京）；玉米穗腐病图像采集与数据处理系统（国家农业信息化工程技术研究中心定制）；水平电泳槽（DYCP-36A，北京）；立式压力蒸汽灭菌器（LS-75HD型，济南）；锥形瓶（150 mL）、超净工作台、显微镜、血球计数板、无菌注射器。

1.2 DNA提取

将选取的单菌株转移到贴有玻璃纸的PDA培养基上，25℃培养5—7 d，刮取菌丝并自然晾干，取3—5 g干菌丝体装于2.0 mL离心管中。用真菌基因组DNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）提取DNA。用Q5000超微量核酸蛋白测定仪测定提取DNA的浓度。

1.3 分子标记和基因测序引物

使用22对SSR引物、10对VNTR引物（表1）对所选镰孢菌进行遗传多样性分析。25 μL反应体系：DNA 模板2 μL、上下游引物各1 μL，12.5 μL 2×TaqPCR Master Mix，ddH2O补足至25 μL。PCR反应程序：94℃预变性4 min；94℃变性45 s，退火温度（视不同引物而定）45 s，72℃延伸1 min，36个循环；最后72℃延伸7 min。

表1 本试验所用引物

续表1 Continued table 1

采用、-以及基因序列（表1）对所选菌株进行分析。的50 μL PCR反应体系：DNA模板2 μL、上下游引物各2 μL、2×TaqPCR Master Mix 25 μL、ddH2O 19 μL。PCR反应程序：94℃预变性 5 min；95℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，36个循环：72℃延伸10 min，4℃保存产物。

-的反应体系同上，PCR反应程序：94℃预变性 4 min；95℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸 1 min，36个循环；72℃延伸7 min，4℃保存产物，DNA扩增片段大小约380 bp。

反应体系同上，PCR反应程序：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，40个循环；72℃延伸7 min，4℃保存产物，DNA 扩增片段大小约800 bp。于1.2%琼脂糖凝胶电泳后检验有条带的扩增产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序拼接结果在NCBI的BLAST模块进行比对分析。

1.4 致病力测定

田间种植：于2019年6月在北京顺义田间种植150行玉米自交品系掖478，每行留10株苗，行距60 cm，株距25 cm，重复两次。

孢子悬浮液的制备：配备合成低营养琼脂（SNA）液体培养基，并倒入60 mL于锥形瓶中，于立式压力蒸汽灭菌器中灭菌，在超净工作台上分别将培养好的禾谷镰孢刮取菌丝，转移至上述锥形瓶中，记下菌株信息，连续光照12 h，25℃下振动培养3—5 d。在显微镜下镜检，使用血球计数板将浓度调至1×106个分生孢子/mL，待用。待田间玉米花丝吐出7—10 d，用无菌注射器吸取孢子悬浮液，每株玉米主穗通过花丝通道接种法[28]注射菌液2 mL，每个菌株注射接种两行玉米，去除主穗外的其他穗并在每行玉米行头做好标记。在玉米蜡熟后期，收集所有接种的玉米果穗，去除苞叶，利用玉米穗腐病图像采集与数据处理系统（国家农业信息化工程技术研究中心定制），测定每个果穗的发病籽粒区域占整个果穗籽粒表面积的百分比，并计算每个菌株所接种果穗（共计20个）的平均发病面积占比。

发病面积（m）百分比计算公式：m=（d/e）×100%，其中d为玉米穗部出现穗腐症状的籽粒表面积，e为玉米穗部全部籽粒的面积。

平均发病面积（me）百分比计算公式：me=（∑mi）/n×100%，n为接种果穗数，mi中i选值从1到n，是每个玉米穗的发病面积百分比。

1.5 毒素化学型测定

对禾谷镰孢复合种进行毒素化学型分子检测，选用引物Tri13a/b。PCR反应程序：94℃预变性4 min；95℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，36个循环；72℃延伸7 min，4℃保存产物，15ADON、3ADON和NIV毒素化学型的菌株扩增片段分别为583、644和859 bp[25]，PCR反应程序同上。分别采用Tri13F/R，扩增片段415 bp，退火温度57℃进行NIV毒素化学型的重复性检测[26]；采用Tri303F/R，退火温度为52℃，扩增片段586 bp，进行3ADON毒素化学型的重复性检验[27]；采用Tri315F/R，退火温度为58℃，扩增片段864 bp，进行15ADON毒素化学型的重复性检验[27]，以鉴定特异性引物的有效性。

1.6 数据处理

穗腐病致病力数据先通过玉米穗腐病图像采集与数据处理系统进行预处理，得到个体的表型数据，利用Excel 2010进行统计分析与处理，计算各组的平均表型值，并进行方差分析。

2 结果

2.1 微卫星引物的SSR扩增

SSR引物在45株禾谷镰孢复合种中共检测到等位位点数48个，多态性位点数39个，多态性条带比率为81.25%，每对引物扩增出的多态性条带为2—4条。对于不同菌株相同引物扩增出的条带，同一片段大小记为‘1’，在同一位置没有扩增条带的记为‘0’。统计条带信息，利用NTsys2.1采用非加权对数算术平均法（UPGMA）构建系统发育树。

2.2 不同地理种群的遗传多样性

对中国7个地理种群的禾谷镰孢复合种菌群进行遗传多样性分析（表2）。东北地区菌群的遗传多样性最为丰富，多态性位点数为39，有效等位基因数1.79，Shannon’s信息指数为0.62，Nei’s遗传多样性指数为0.43。禾谷镰孢复合种7个地理种群的多态性位点数在10—39，平均Shannon’s信息指数为0.41，平均Nei’s遗传多样性指数为0.29，表明禾谷镰孢复合种具有较丰富的遗传多样性。7个地理种群禾谷镰孢复合种的Nei’s遗传相似度为0.6677—0.8797，其中东北和西北地区的最高，而华中与西南地区的最低，表明华中和西南地区的菌群表现出较高的遗传多样性；遗传距离为0.1282—0.4039，表明7个区域间的种群分布较为分散（表3）。

表2 禾谷镰孢复合种的遗传多样性

表3 禾谷镰孢复合种遗传相似度和遗传距离

2.3 禾谷镰孢复合种地理种群的聚类分析

依据统计结果用NTsys2.1对禾谷镰孢复合种7个地理种群遗传距离进行UPGMA聚类分析，菌群在相似系数为0.77时，被聚类为3个大的分支，华北地区的菌株单独聚为一类，东北、西北、西南、华南地区的菌株聚为一大类群，华中和华东地区的同在一分支（图1）。

图1 禾谷镰孢复合种7个地理种群的聚类分析图

2.4 STRUCTURE群体结构分析

使用结构分析STRUCTURE2.3.4软件的贝叶斯聚类法对禾谷镰孢复合种地理种群的群体遗传结构进行分析，参数Length of Bunrin Period设为25 000，Numbers of MCMC Reps after Bunrin设为1 000 000，将K设置为1—10，K重复次数Number of Iterations设为10，将运行结果转换成压缩包文件在网站Structure Harvest（http://taylor0.biology.ucla.edu/structure Harvester/）中利用Evanno等[29]ΔK方法计算LnP（K）值、ΔK值和K的最大可能值，结果图2所示，LnP（K）值随着K值增大而增大，表明镰孢菌群体间存在遗传分化，当K值为2时，ΔK取最大为150，表明7个地理群体的禾谷镰孢复合种分为两个类群最合适。

进一步研究STRUCTURE软件分析得到的菌群和地理区域间的关系发现，禾谷镰孢复合种在两个类群中，西北地区绝大部分属于类群A，华中地区和华南地区菌株均属于类群B，东北地区50%以上菌株属于类群B（图3）。

图2 禾谷镰孢复合种取不同K值时的ΔK值曲线图

图3 禾谷镰孢复合种群体结构图（当K值为2时）

2.5 基于基因序列构建禾谷镰孢复合种树形图

通过、和基因测序对禾谷镰孢复合种的3个基因片段序列按相同顺序拼接起来，并用MEGA7.0软件构建树形图进行系统发育分析（图4）。最终，禾谷镰孢复合种被分为4大类群，分支标记为红色的以亚洲镰孢为主，包括广西、四川、陕西等相邻地区；分支标记为浅绿色的以布氏镰孢为主，分布在甘肃、黑龙江、北京等相邻地区；分支标记为蓝色的以南方镰孢为主，包括贵州、重庆、云南、广西和陕西等地区；分支标记为黑色（蓝色分支的下部）的以禾谷镰孢为代表，包括黑龙江、河南、辽宁、陕西、山东和北京地区。各地区之间菌种组成不尽相同，禾谷镰孢和布氏镰孢多分布在北方冷凉地区，亚洲镰孢和南方镰孢多分布于南方温湿地区，在北方地区也鲜有分布，从树形图来看，各镰孢菌种内部也存在小的分支，表明无论种间、种内遗传多样性均较为丰富。各地区间存在着丰富的遗传变异，尤其是相邻地区种间存在较频繁的基因交流与交换。使用MEGA7.0软件分析3个基因的序列，在全长1 800 bp的片段上，发现了142个单核苷酸多态性位点（SNP）。

2.6 镰孢菌致病力测定与毒素化学型分析

禾谷镰孢复合种以15ADON毒素化学型为主，共32株，3ADON次之，共15株，NIV 5株；3ADON主要在西北、华南、西南地区分布，有两株菌能同时产生15ADON和3ADON，两株菌能同时产生3种毒素化学型，一株菌能同时产生15ADON和NIV；15ADON、NIV和3ADON平均发病面积百分比分别为17.87%、17.20%和12.37%，能同时产生3种毒素化学型的菌株平均发病面积百分比为16.36%，略高于3种类型总平均发病面积百分比。禾谷镰孢平均发病面积百分比最大，为20.79%；亚洲镰孢、布氏镰孢和南方镰孢的平均发病面积百分比分别为15.79%、11.77%和8.12%，禾谷镰孢的致病力在4种镰孢菌中最强。禾谷镰孢复合种在东北、华东、西南、华南、华北、华中和西北地区平均发病面积百分比分别为20.85%、18.00%、9.81%、15.22%、13.74%、13.65%和12.33%。禾谷镰孢毒素化学型为15ADON、3ADON、NIV和3ADON+ 15ADON+NIV 4种，以15ADON为主；布氏镰孢毒素化学型为15ADON、3ADON、NIV、3ADON+15ADON和3ADON+15ADON+NIV 5种，以15ADON为主；亚洲镰孢毒素化学型只有3ADON；南方镰孢毒素化学型为15ADON、3ADON、15ADON+NIV 3种，15ADON为优势类型（表4）。不同镰孢种引起的穗腐病平均发病面积占比存在显著差异（=0.011＜0.05），表明不同镰孢种之间的致病力存在较大差异（表5、表6）。禾谷镰孢复合种在7大地理区域的菌群构成、致病力和毒素化学型分布不均匀。

图4 禾谷镰孢复合种RPB2+TEF-1α+β-tubulin基因聚类图

3 讨论

玉米穗腐病是一种在世界各玉米种植区频繁发生的真菌病害，主要病原真菌为镰孢菌。禾谷镰孢复合种可侵染玉米根、茎、穗、叶，引起根腐病、茎腐病、穗腐病、叶斑病等病害，其产生多种真菌毒素严重影响玉米籽粒的品质和安全，给生产者造成巨大损失[30-31]。目前，禾谷镰孢复合种至少包括16个种，我国已鉴定出10个种，本研究中的禾谷镰孢复合种由禾谷镰孢、布氏镰孢、南方镰孢和亚洲镰孢组成。禾谷镰孢在南北方均有分布；布氏镰孢主要分布在东北、西北和华北等较冷凉地区；亚洲镰孢多分布于华南地区，在东北、西南和西北地区也有少量分布；南方镰孢则主要分布在西南、华南等较温暖地区，与前人相关的研究结果基本一致[5]。本研究首次利用玉米穗腐病图像采集与数据处理系统（国家农业信息化工程技术研究中心定制）进行穗腐病发病面积调查与数据自动化处理，穗部发病面积占比由该系统通过AI识别测定后自动生成，结果比较精确；而以往玉米穗腐病发病情况调查均由人工观察估测，同一份材料由不同的人调查或同一个人调查不同材料的发病情况时，不可避免地产生不同程度的误差。通过该系统测定处理的数据，消除了人为造成的误差，能真实反映出不同镰孢菌株所致穗腐病的发病严重程度。

马红霞等[15]报道在中国春玉米区和夏玉米区禾谷镰孢复合种的毒素化学型主要为DON和15ADON，温暖地区如长江流域则以3ADON和NIV为主；本研究组[2]于2018—2019年全面分析了黑龙江地区禾谷镰孢复合种的毒素化学型，发现禾谷镰孢与布氏镰孢均以产DON毒素衍生物为主，仅1株亚洲镰孢产NIV毒素；Aamot等[32]报道了挪威小麦赤霉病病原菌禾谷镰孢以3ADON类型占主导；Sneideris等[17]在57株禾谷镰孢中发现47株能产生15ADON。在本研究中，禾谷镰孢复合种的毒素化学型较为丰富，禾谷镰孢、布氏镰孢和南方镰孢均能产生15ADON、3ADON和NIV 3种毒素化学型，亚洲镰孢只发现3ADON型，总体以15ADON和3ADON型占主导，其中15ADON类型的最多，产生NIV的菌株较少，与前人相关研究对比不难发现，优势产毒类型的菌群已发生一定程度的变化。

有关禾谷镰孢复合种的致病力分析在小麦上报道较多，在玉米穗腐病上报道很少。Ward等[33]研究发现，小麦赤霉病病原菌禾谷镰孢产3ADON的菌株与产15ADON的菌株相比，单端孢霉烯含量更高，且繁殖力更强、生长速率更快；李伟等[34]利用30株小麦赤霉病的亚洲镰孢和1株禾谷镰孢进行致病力测定及毒素化学型分析，结果表明在长江流域，产3ADON的亚洲镰孢致病力最强，产15ADON的亚洲镰孢菌株在小麦品种上表现的致病力很弱；杜青等[35]对广西地区禾谷镰孢复合种进行毒素化学型分析未检测到产3ADON的菌株。本研究表明，对于玉米穗腐病而言，产15ADON毒素化学型菌株比产3ADON毒素化学型菌株的致病力强，结论有所不同，可能与李伟等[34]的研究中产15ADON的菌株样本量太少（仅1株）有关，也可能与寄主植物本身的特性有关。GAI等[14]对40株禾谷镰孢菌复合种致病力测定中，得到各菌株的病情指数在58.9—89.3，且致病力不存在地域性差异；但本试验发现北方区域菌株致病力较南方的强，总体而言，由北向南禾谷镰孢复合种致病力逐渐减弱。样本的数量选取对试验结果影响较大，尤其是遗传多样性分析，样本群体数量足够大，可能包含的基因越丰富，毒素化学型也更全面，本研究囿于材料等的限制（结合前人的研究，特定菌株在一些地区的玉米穗腐样本上分离频率比较低[2,5-6,15]，本试验也如此，例如南方镰孢主要在南方地区分布，布氏镰孢主要在北方地区有分布，一些地区虽然分离了大量的禾谷镰孢，但为了保证试验均衡及代表性，去掉了同一地理来源的菌株），在样本选取上最大限度地保证禾谷镰孢复合种菌种的多样化以及每个菌株地理来源的差异性，因此，尽管菌株数量偏少，但所选菌株具有较好的代表性。下一步可以扩大样品的采集数目并对样本数量最优选取进行探讨，以选出最适合试验的菌群数。

表4 禾谷镰孢复合种致病力与毒素化学型

表5 不同镰孢种引起的穗腐病发病面积占比统计分析

表6 不同镰孢种致病力方差分析

禾谷镰孢复合种存在大量的单核苷酸多态性位点，具有高度适应环境的潜力，将遗传变异与表型变化联系起来仍然具有挑战性。Laurent等[36]使用全基因组重测序在单核苷酸水平上研究了6个法国禾谷镰孢的基因组多样性，共检测到242 756个高度可信遗传变异位点，其中96%为单核苷酸多态性，约80%的禾谷镰孢编码蛋白的基因上产生了多态性。本研究通过SSR+VNTR分子标记结合、和基因测序对禾谷镰孢复合种进行遗传多样性分析，通过比较3个基因序列，共发现142个单核苷酸多态性位点，说明禾谷镰孢遗传变异具有高度的适应性。与传统的利用分子标记特异性扩增来分析镰孢菌的遗传多样性相比，利用基因测序，通过这些差异序列构建的聚类图能清楚显示出各种内与种间的遗传分化情况，构建树形图更精细，分支更多而精准，甚至还能比较任意两个菌株的单核苷酸多态性，但其不能覆盖菌株所有的染色体，将二者结合，进行局部和整体的全面分析，有利于深入研究。

马红霞等[15]研究发现，相同地理来源例如同属春玉米区或夏玉米区的菌株有较近的亲缘关系，且不同地理种群间存在基因交流，遗传多样性水平与地理来源有关。本研究发现在7大地理区域，菌群构成、致病力和毒素化学型分布都不均匀，华中和华东地区菌群亲缘关系较近，西南和东南、东北和西北地区菌群亲缘关系较近。Aamot等[32]研究了挪威45株禾谷镰孢复合种的平均遗传多样性指数（H）在0.17—0.43，发现近些年采集的菌株要比前些年收集菌群的遗传多样性数值高。随着人们农业生产活动多元化，致病菌间的基因交流会愈加频繁，遗传多样性水平也会因此上升，是否会导致侵染性更强，需要多年持续跟踪的研究。

4 结论

禾谷镰孢复合种包括禾谷镰孢、布氏镰孢、亚洲镰孢和南方镰孢，其毒素化学型含15ADON、3ADON、NIV及其组合型，以15ADON和3ADON为主，禾谷镰孢的致病力在4种镰孢菌中最强，且致病力强弱与毒素化学型有关。基于SSR和VNTR分子标记结合、和基因测序分析，表明在7个地理区域内部或各区域之间，禾谷镰孢复合种群体各镰孢菌种间和种内均存在丰富的遗传变异，相邻区域间镰孢菌的基因交流与交换发生频繁；遗传多样性水平与地理来源、菌种构成、毒素化学型以及样本量均有关。

[1] 王晓鸣, 段灿星. 玉米病害和病原名称整理及其汉译名称规范化探讨. 中国农业科学, 2020, 53(2): 288-316.

WANG X M, DUAN C X. Reorganization of maize disease and causal agent names and disscution on their standardized translation of Chinese names., 2020, 53(2): 288-316. (in Chinese)

[2] 王宝宝, 毕四刚, 肖明纲, 张冬英, 闫强, 张彦彦, 杨树龙, 朱振东, 段灿星. 黑龙江省玉米穗腐病致病镰孢菌分离鉴定及产毒基因型分析. 草业学报, 2020, 29(1): 163-174.

WANG B B, BI S G, XIAO M G, ZHANG D Y, YAN Q, ZHANG Y Y, YANG S L, ZHU Z D, DUAN C X. Isolation and identification of pathogenicspp. causing maize ear rot and analysis of their toxin-producing genotype in Heilongjiang Province., 2020, 29(1): 163-174. (in Chinese)

[3] DUAN C X, QIN Z H, YANG Z H, LI W X, SUN S L, ZHU Z D, WANG X M. Identification of pathogenicspp. causing maize ear rot and potential mycotoxin production in China., 2016, 8(6): 186.

[4] 段灿星, 王晓鸣, 宋凤景, 孙素丽, 周丹妮, 朱振东. 玉米抗穗腐病研究进展. 中国农业科学, 2015, 48(11): 2152-2164.

Duan C X, Wang X M, Song F J, Sun S L, Zhou D N, Zhu Z D. Advances in research on maize resistance to ear rot., 2015, 48(11): 2152-2164. (in Chinese)

[5] 秦子惠, 任旭, 江凯, 武小菲, 杨知还, 王晓鸣. 我国玉米穗腐病致病镰孢种群及禾谷镰孢复合种的鉴定. 植物保护学报, 2014, 41(5): 589-596.

QIN Z H, REN X, JIANG K, WU X F, YANG Z H, WANG X M. Identification ofspecies andspecies complex causing maize ear rot in China., 2014, 41(5): 589-596. (in Chinese)

[6] 周丹妮, 王晓鸣, 李丹丹, 杨洋, 陈国康, 段灿星. 重庆及周边地区玉米穗腐病致病镰孢菌的分离与鉴定. 植物保护学报, 2016, 43(5): 782-788.

Zhou D N, Wang X M, Li D D, Yang Y, Chen G K, Duan C X. Isolation and identification ofspecies causing maize ear rot in Chongqing and its vicinity., 2016, 43(5): 782-788. (in Chinese)

[7] LI L, QU Q, CAO Z, GUO Z, JIA H, LIU N, WANG Y, DONG J. The relationship analysis on corn stalk rot and ear rot according tospecies and fumonisin contamination in kernels., 2019, 11(6): 320.

[8] ZHU Z, HAO Y, MERGOUM M, BAI G, HUMPHREYS G, CLOUTIER S, XIA X, HE Z. Breeding wheat for resistance to Fusarium head blight in the Global North: China, USA and Canada., 2019, 7(6): 730-738.

[9] 支叶, 孙菲菲, 孙素丽, 段灿星, 朱振东. 黑龙江省大豆根腐病菌锐顶镰孢鉴定. 中国油料作物学报, 2014, 36(6): 789-793.

ZHI Y, SUN F F, SUN S L, DUAN C X, ZHU Z D. Identification ofcausing soybean root rot in Heilongjiang Province., 2014, 36(6): 789-793. (in Chinese)

[10] DONG F, ZHANG X, XU J, SHI J, LEE Y W, CHEN X, LI Y, MOKOENA M P, Olaniran A O. Analysis ofspecies complex from freshly harvested rice in Jiangsu Province (China)., 2020, 104(8): doi: 10.1094/PDIS- 01-20-0084-RE.

[11] GROMADZKA K, BLASZCZYK L, CHELKOWSKI J, WASKIEWICZ A. Occurrence of mycotoxigenicspecies and competitive fungi on preharvest maize ear rot in Poland., 2019, 11(4): 224.

[12] MIEDANER T, GWIAZDOWSKA D, WASKIEWICZ A. Editorial: management ofspecies and their mycotoxins in cereal food and feed., 2017, 8: 1543.

[13] GAIKPA D S, MIEDANER T. Genomics-assisted breeding for ear rot resistances and reduced mycotoxin contamination in maize: methods, advances and prospects., 2019, 132(10): 2721-2739.

[14] GAI X T, XUAN Y H, GAO Z G. Diversity and pathogenicity ofspecies complex from corn stalk and ear rot strains in northeast China., 2017, 66(8): 1267-1275.

[15] 马红霞, 孙华, 郭宁, 张海剑, 石洁, 常佳迎. 禾谷镰孢复合种毒素化学型及遗传多样性分析. 中国农业科学, 2018, 51(1): 82-95.

MA H X, SUN H, GUO N, ZHANG H J, SHI J, CHANG J Y. Analysis of toxigenic chemotype and genetic diversity of thespecies complex., 2018, 51(1): 82-95. (in Chinese)

[16] YERKOVICH N, FUMERO M V, CANTORO R, PALAZZINI J M, CHULZE S N. Population structure and genetic diversity ofsensu stricto, the main wheat pathogen producing Fusarium head blight in Argentina., 2020, 156(2): 635-646.

[17] SNEIDERIS D, IVANAUSKAS A, SUPRONIENE S, KADZIENE G, SAKALAUSKAS S. Genetic diversity ofisolated from weeds., 2019, 153(2): 639-643.

[18] 任旭. 我国玉米穗腐病主要致病镰孢菌多样性研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2011.

REN X. Diversity analyses ofspp., the main causal agents of maize ear rot in China[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2011. (in Chinese)

[19] 李新凤, 王建明, 姜晓东, 郝晓娟, 张祖维, 田宏先. 拟轮枝镰孢菌EST-SSR信息分析与标记开发. 植物保护学报, 2018, 45(4): 819-826.

LI X F, WANG J M, JIANG X D, HAO X J, ZHANG Z W, TIAN H X. EST-SSR information analysis and marker development for genetic diversity analysis of., 2018, 45(4): 819-826. (in Chinese)

[20] SCOTT J B, CHAKRABORTY S. Identification of 11 polymorphic simple sequence repeat loci in the phytopathogenic fungusas a tool for genetic studies., 2008, 8(3): 628-630.

[21] SUHA H, GALE L R, KISTLER H C. Development of VNTR markers for twoclade species., 2004, 4(3): 468-470.

[22] O’DONNELL K, WARD T J, ABERRA D, KISTLER H C, AOKI T, ORWIG N, KIMURA M, BJORNSTAD A, KLEMSDAL S S. Multilocus genotyping and molecular phylogenetics resolve a novel head blight pathogen within thespecies complex from Ethiopia., 2008, 45(11): 1514-1522.

[23] HUBKA V, KOLARIK M.paralogueis frequently misidentified as thegene insectiontaxonomy: Primer specificity testing and taxonomic consequences., 2012, 29: 1-10.

[24] LOFGREN L A, LEBLANC N R, CERTANO A K, NACHTIGALL J, LABINE K M, RIDDLE J, Broz K, Dong Y, Bethan B, Kafer C W, KISTLER H C.: pathogen or endophyte of North American grasses?., 2018, 217(3): 1203-1212.

[25] WANG J H, LI H P, QU B, ZHANG J B, HUANG T, CHEN F F, LIAO Y C. Development of a generic PCR detection of 3- acetyldeoxynivalenol-, 15-acetyldeoxynivalenol- and nivalenol- chemotypes ofclade., 2008, 9(12): 2495-2504.

[26] WAALWIJK C, KASTELEIN P, DE VRIES I, KERÉNYI Z, VAN DER LEE T, HESSELINK T, KÖHL J, KEMA G. Major changes inspp. in wheat in the Netherlands., 2003, 109(7): 743-754.

[27] JENNINGS P, COATES M E, TURNER J A, CHANDLER E A, NICHOLSON P. Determination of deoxynivalenol and nivalenol chemotypes ofisolates from England and Wales by PCR assay., 2004, 53(2): 182-190.

[28] DUAN C X, WANG B B, SUN F F, YANG Z H, ZHU Z D, WANG X M. Occurrence of maize ear rot caused byin China., 2020, 104(2): 587.

[29] EVANNO G, REGNAUT S, GOUDET J. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study., 2005, 14(8): 2611-2620.

[30] BEUKES I, ROSE L J, VAN COLLER G J, VILJOEN A. Disease development and mycotoxin production by thespecies complex associated with South African maize and wheat., 2018, 150: 893-910.

[31] COAN M, SENHORINHO H J, PINTO R J, SCAPIM C A, TESSMANN D J, WILLIAMS W P, WARBURTON M L. Genome-wide association study of resistance to ear rot byin a tropical field maize and popcorn core collection., 2018, 58(2): 564-578.

[32] AAMOT H U, WARD T J, BRODAL G, VRALSTAD T, LARSEN G B, KLEMSDAL S S, ELAMEEN A, UHLIG S, HOFGAARD I S. Genetic and phenotypic diversity within thespecies complex in Norway., 2015, 142(3): 501-519.

[33] WARD T J, CLEAR R M, ROONEY A P, O’DONNELL K, GABA D, PATRICK S, Starkey D E, Gilbert J, Geiser D M, NOWICKI T W. An adaptive evolutionary shift in Fusarium head blight pathogen populations is driving the rapid spread of more toxigenicin North America., 2008, 45(4): 473-484.

[34] 李伟, 胡迎春, 陈莹, 张爱香, 陈怀谷. 长江流域禾谷镰孢菌群部分菌株系统发育学、产毒素化学型及致病力研究. 菌物学报, 2010, 29(1): 51-58.

LI W, HU Y C, CHEN Y, ZHANG A X, CHEN H G. Phylogenetic analysis, chemotype diversity, and pathogenicity of theclade in the Yangtze basin., 2010, 29(1): 51-58. (in Chinese)

[35] 杜青, 唐照磊, 李石初, 上官玲玲, 李华娇, 段灿星. 广西玉米穗腐病致病镰孢种群构成与毒素化学型分析. 中国农业科学, 2019, 52(11): 1895-1907.

DU Q, TANG Z L, LI S C, SHANGGUAN L L, DUAN C X. Composition ofspecies causing maize ear rot and analysis of toxigenic chemotype in Guangxi., 2019, 52(11): 1895-1907. (in Chinese)

[36] LAURENT B, MOINARD M, SPATARO C, PONTS N, BARREAU C, FOULONGNE-ORIOL M. Landscape of genomic diversity and host adaptation in., 2017, 18: 203.

The Genetic Diversity, Pathogenicity, and Toxigenic Chemotypes ofSpecies Complex Causing Maize Ear Rot

WANG BaoBao1, GUO Cheng2, SUN SuLi1, XIA YuSheng1, ZHU ZhenDong1, DUAN CanXing1

(1Institute of Crop Sciences/National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2Institute of Plant Protection, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070)

【】The objective of this study is to clarify the genetic structure, pathogenicity, toxigenic chemotypes, and their relationship ofspecies complex (FGSC) causing maize ear rot in China, and to provide reference information for prevention and control of Fusarium ear rot of maize.【】The samples were collected from the main maize producing areas in China. Twenty-two pairs of SSR and 10 pairs of VNTR primers, along with,andgene sequences were used for genetic diversity and Popgen32, NTsys2.1, and STRUCTURE2.3.4 software were used to analyze the data and construct the phylogenetic tree. The pathogenicity of FGSC was determined using the silk channel injection inoculation method, and the specific primers were used to detect the toxigenic chemotypes.【】A total of 48 alleles were detected by SSR and VNTR primers, 39 polymorphic sites were found, with a polymorphic band ratio of 81.25% among 45 strains, the polymorphic bands ranged from 2 to 4. The average Shannon’s information index and Nei’s genetic diversity index of the 7 FGSC geographic populations were 0.41 and 0.29, respectively, the genetic similarity in 7 regions was 0.6677-0.8797, and the genetic distance was 0.1282-0.4039, indicating that there existed rich genetic diversity among the flora. Based on the Nei’s genetic distance, 7 FGSC geographical populations were divided into 3 groups by UPGMA clustering. The population structure of FGSC stains could be divided into two different groups by STRUCTURE2.3.4.Most of the strains from Northwest China belonged to group A, those in Central China and South China belonged to group B, and more than 50% of the strains in Northeast China belonged to group B. Based on the sequences of,-and, FGSC was composed of,,, and.There were 142 single nucleotide polymorphisms (SNPs) among thesestrains. The dendrogram constructed by these differential sequences could clearly show the genetic differentiation within and between species. The genetic diversity within eachspecies was rich. Among fourspecies, the pathogenicity ofwas the strongest, with an average diseased ear area of 20.79%. The average diseased areas of,, andwere 15.79%, 11.77%, and 8.12%, respectively. The difference in the percentage of average diseased area was significant betweenspecies. The toxigenic chemotypes ofwere 15ADON, 3ADON, NIV, and 3ADON + 15ADON + NIV,contained 15ADON, 3ADON, NIV, 3ADON + 15ADON, and 3ADON + 15ADON + NIV chemotypes, the toxigenic chemotypesofwere 15ADON, 3ADON, and 15ADON+ NIV, the 15ADON chemotype was the most frequently detected, whilemerely contained 3ADON chemotype. In addition, the average diseased ear areas of 15ADON, NIV and 3ADON type strains were 17.87%, 17.20%, and 12.37%, respectively.【】There existed frequent gene exchanges between different FGSC geographical populations, especially in adjacent regions. 15ADON type is the predominant toxigenic chemotype of FGSC in 7 geographic regions. The pathogenicity ofis the strongest, followed by,,andaccording to the percentage of the diseased area caused by differentspecies. In this study, the correlation between toxigenic chemotypes andspecies is not significant, and the pathogenicity is mainly related tospecies.

maize ear rot;species complex (FGSC); genetic diversity; toxigenic chemotype; pathogenicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.23.005

2020-03-26；

2020-05-06

国家重点研发计划（2016YFD0100103）、农作物种质资源保护与利用专项（2020NWB036-12）、中国农业科学院农业科技创新工程

王宝宝，E-mail：1443094080@qq.com。通信作者段灿星，E-mail：duancanxing@caas.cn

（责任编辑 岳梅）