苦荞ARF基因家族的鉴定及生长素诱导下的表达模式

郝彦蓉，杜伟，侯思宇，王东航，冯红梅，韩渊怀，周美亮，张凯旋，刘龙龙，王俊珍，李红英，孙朝霞

苦荞ARF基因家族的鉴定及生长素诱导下的表达模式

郝彦蓉1，杜伟1，侯思宇1，王东航1，冯红梅1，韩渊怀1，周美亮2，张凯旋2，刘龙龙3，王俊珍4，李红英1，孙朝霞1

（1山西农业大学农学院，山西太谷 030801；2中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081；3山西农业大学农业基因资源研究中心，太原 030031；4凉山州西昌农业科学研究所，四川西昌 615000）

【】全基因组水平鉴定苦荞ARF家族基因，并对其家族基因结构、保守结构域、系统进化、组织表达差异及外源生长素处理下基因表达水平进行分析，为苦荞ARF的功能研究和利用奠定基础。通过转录组数据和ARF保守结构域（PF06507）分析，筛选苦荞ARF家族成员，利用TBtools软件绘制基因结构图，利用NCBI及MEME在线预测苦荞ARF蛋白保守结构域和保守基序，利用MEGA X构建苦荞和拟南芥、水稻、甜荞、甜菜、大豆ARF蛋白系统进化树。使用根、茎、叶、花、未成熟和成熟籽粒6个组织转录组数据的FPKM值，通过TBtools HeatMap绘制FtARFs基因表达热图，分析FtARFs的组织表达特异性。使用PlantCARE在线网站预测茎秆特异表达的FtARFs启动子的顺式作用元件。以0.5 mg·L-1IAA处理2份高秆（ZNQ189和PI673849）与2份矮秆（PI658429和PI647612）苦荞材料，观察苦荞下胚轴伸长的特征，于生长素处理不同时间段（0、0.5、1、6、12、24和48 h）取样，qRT-PCR检测FtARFs基因在不同苦荞下胚轴中的表达差异；同时，对生长7 d的4份材料进行石蜡切片，番红固绿染色后显微镜下观察下胚轴细胞大小。系统分析鉴定了26个苦荞ARF家族基因，染色体定位分析显示，除第4染色体外，FtARFs在其余染色体均有分布。理化性质分析表明，氨基酸残基数目范围为331—1 083 aa，理论等电点为5.34—8.63。保守基序分析表明，不同组间Motif组成有一定的差异。基因结构分析显示，苦荞ARF基因外显子数量为2—15，变异较大。系统进化将其分成4组（GroupⅠ—Group Ⅳ），且苦荞FtARFs在4个类群中均有分布。组织特异性分析显示，在各组织中，FtARFs基因FPKM值差异明显，在根、茎、花中，分别检测到7个、9个和4个基因表达量较高，在叶、未成熟籽粒和成熟籽粒中，表达值均较低。外源生长素处理4份苦荞材料，下胚轴伸长趋势不一，与其细胞大小变化相一致。qRT-PCR结果显示，FtARFs基因在生长素处理前期（0.5—1 h）表达较高，在处理后期，基因表达量降低。且处理苦荞幼苗0.5 h时，大多数FtARFs基因被显著诱导表达。苦荞ARF基因结构和蛋白基序具有组间多样性和组内保守性，且具有组织表达特异性，9个茎秆特异表达的FtARFs基因响应IAA诱导，暗示其对苦荞茎秆伸长可能具有调控作用。

苦荞；ARF基因家族；生长素；株高；基因表达

0 引言

【研究意义】荞麦（）是起源于中国的蓼科双子叶杂粮作物，距今已有2 000多年的栽培史[1]。苦荞（）是重要的荞麦栽培种，其适应性广，营养价值高，已成为备受关注的“药食同源”作物[2]。苦荞中氨基酸含量均衡，富含人体必需氨基酸，特别是主粮作物较为缺乏的赖氨酸，特有的黄酮类物质——芦丁，更使其在营养保健方面功效显著[3]。但由于苦荞自身的结构特点，植株较高、茎秆中空、脆性强，使得苦荞在生长发育过程中容易受到外界自然环境的影响，发生茎秆倒伏和弯曲，造成收获困难，制约苦荞产量的提升[4-5]。因此，探讨苦荞株高影响因素，可在一定程度上提高苦荞产量，提升苦荞收获指数，促进农民种植积极性。【前人研究进展】苦荞株高由基因型决定，随栽培条件（包括水肥、土壤等条件）、地理环境而变化。植物节间缩短、节间数减少或细胞伸长异常等都与植物激素调控相关[6]，研究发现，GA、BR、SLs、IAA等植物激素的合成或信号转导都与植物株高有关[7-10]。生长素（auxin）作为最早被人们发现的植物激素，具有调节茎的生长速率、抑制侧芽、促进生根等作用[11]，参与植物生长调控的大部分过程。而植物对生长素的反应受许多基因的调控[12]，生长素响应因子（auxin response factor，ARF）则是其中一类较为重要的转录因子，它能够特异地与生长素响应基因启动子区域的生长素响应元件（auxin response element，AuxRE）TGTCTC结合，激活或抑制基因的表达，从而调控植物的生长发育[13]。ARF基因已在不同物种的基因组中被鉴定出来，最早是在模式植物拟南芥中被发现的，目前已有23个ARF成员[14]，随后在水稻[15]、杨树[16]、玉米[17]、番茄[18]、大豆[19]、葡萄[20]等植物中也鉴定出ARF基因家族。Wu等[21]研究发现在拟南芥中过表达芒果抑制了根和下胚轴的生长。Jung等[22]研究发现拟南芥突变体叶片变小，生育能力降低，表现出植株矮化，在该突变体中的转录水平显著升高。Huang等[23]研究发现水稻过表达抗性转基因植株的，在生长发育中表现出多种缺陷，包括植株矮化、叶片卷曲和种子变小等。【本研究切入点】苦荞基因组测序的完成[24]，更有利于苦荞基因的鉴定及功能分析，尽管Liu等[25]对苦荞ARF基因家族已有报道，但其调控下胚轴伸长的机理尚不明确。【拟解决的关键问题】本研究从转录组数据入手，鉴定苦荞ARF基因家族成员并分析其结构特征，分析其在不同组织器官中的表达规律以及研究其在生长素信号途径中的作用，将有助于解析该家族基因的作用机制，也为进一步解析苦荞ARF基因与株高的关系，解决生产上苦荞易倒伏、产量降低的问题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

以黑丰一号苦荞为试验材料，2019年种植于山西农业大学农作站。大田种植取生长状态良好植株的幼嫩根、茎、新叶、开放花、未成熟籽粒和成熟籽粒于1.5 mL离心管中，液氮速冻后储存于-80℃备用。选取4份苦荞资源PI658429、PI647612、ZNQ189、PI673849进行外源生长素处理（所有材料均来源于山西农业大学）。室内试验在中国农业科学院荞麦基因资源创新研究组进行。

1.2 苦荞转录组测序及FtARFs基因筛选

利用RNA-seq对苦荞黑丰一号根、茎、叶、花、未成熟籽粒和成熟籽粒6个组织（每个组织3份重复），共计18个样品进行转录组分析。

以“auxin response factor”为关键词，对上述转录组测序结果中NR注释信息进行筛选，挑选出生长素响应因子（ARFs）家族成员，结合pfam注释信息，筛选含有Auxin_resp结构域的基因。以已公布的pinku基因组为参考基因组（http://www.mbkbase.org/Pinku1），获得苦荞ARF基因的序列信息，包括核酸序列、蛋白序列、CDS序列和基因位置信息。

1.3 苦荞ARF基因的结构、理化性质、染色体定位和启动子序列分析

使用NCBI CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）在线预测苦荞ARF蛋白结构域，使用MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）在线预测蛋白基序。TBtools软件（https://github. com/CJ-Chen/TBtools）绘制可视化图片，并对基因结构进行分析。采用ExPasy（https://web.expasy.org/ protparam）在线软件预测苦荞ARF蛋白的等电点（isoelectric point，）和分子量（molecular weight，MW），使用MG2C网站（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0）绘制FtARFs染色体分布图，按照基因在染色体上的排列顺序进行命名。利用PlantCARE网站（http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）在线预测FtARFs转录起始位点上游2 000 bp序列的顺式作用元件，分析其激素应答、环境胁迫类型。

1.4 系统进化树的构建

利用String网站（https://string-db.org）将苦荞ARF蛋白与甜菜（）、拟南芥（）进行同源比对，获取同源基因；在BGDB网站（http://buckwheat.kazusa.or.jp/keyword.html）下载甜荞（）ARF蛋白序列；PlantTFDB（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn）网站下载水稻（）和大豆（）ARF蛋白序列，利用Muscle对这六个物种的ARF蛋白进行多序列比对，利用MEGA X软件采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）分别构建苦荞ARF基因家族进化树及苦荞、甜荞、甜菜、拟南芥、水稻和大豆的系统进化树，校验参数bootstrap设置为1 000，其余参数均为默认值。

1.5 外源激素处理及FtARFs表达量分析

从苦荞转录组数据中获得FtARFs在根、茎、叶、花、未成熟和成熟籽粒中的FPKM值，利用TBtools软件绘制基因表达热图，分析在不同组织中特异表达的基因，为了检测在苦荞茎秆发育过程中，FtARFs的表达是否受到生长素的调控，对苦荞幼苗进行外源生长素处理。

田间调查100份苦荞资源的株高与主茎节数，筛选2017—2019年株高较稳定资源4份（高秆2份：ZNQ189与PI673849，矮秆2份：PI658429与PI647612），于MS固体培养基培养7 d后，取3株长势一致的无菌苗于液体MS培养基中，室温震荡（120 r/min）1 d后，加入0.5 mg·L-1IAA（IAA溶于二甲基亚砜（DMSO）中），于不同时间（0、0.5、1、6、12、24和48 h）对下胚轴取样，对照组添加同体积的二甲基亚砜。取50—100 mg样品加液氮充分研磨后，利用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）提取上述样品的RNA，使用HiScript® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）试剂盒（南京诺唯赞生物技术有限公司）进行反转录获得cDNA第一链，保存于-20℃备用。以为内参基因，同时设计FtARFs基因特异引物（表1），以上述cDNA为模板，使用南京诺唯赞生物技术有限公司试剂盒进行qRT-PCR检测，设置生物学重复3次，使用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

表1 引物序列

1.6 苦荞下胚轴石蜡切片观察

含有0.5 mg·L-1IAA的MS固体培养基培养4份材料7 d后，各取10株无菌苗统计下胚轴长度；同时，取1 cm左右下胚轴鲜样，用FAA固定液（甲醛5 mL+冰醋酸5 mL+70%乙醇90 mL）固定24 h以上，参照王茜茹等[26]方法进行石蜡切片，经番红固绿染色后，于LEICA DM500光学显微镜下进行观察。

1.7 数据分析

使用excel 2019办公软件进行数据分析。利用欧氏层次聚类方法，使用TBtools绘制热图。使用GraphPad Prism 5（San Diego California USA，www.graphpad.com）进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 FtARFs筛选及蛋白理化性质分析

通过对转录组数据中NR注释信息的筛选，共筛选出41个苦荞ARF候选基因，对上述候选基因pfam注释信息进行分析，剔除不含有典型ARF结构域的冗余蛋白后，最终得到26个苦荞ARF基因，并绘制出FtARFs基因在8条染色体上的分布图（图1），结果显示，除Chr.4（第4染色体）外，均有ARF基因分布。其中在Chr.3分布最多，包含5个基因，其次为Chr.1、Chr.2、Chr.5和Chr.8上各有4个基因分布，而在Chr.6和Chr.7仅有2—3个基因分布。根据苦荞ARF基因在染色体上的物理位置分布，按顺序命名为—。理化性质分析表明，蛋白长度为331—1 083 aa，CDS长度为720—3 252 bp，分子量为37.18—120.49 kD，理论等电点为5.34—8.63。

2.2 苦荞ARF系统进化及蛋白结构域、蛋白基序和基因结构分析

系统进化树分析可将苦荞ARF蛋白分为4组，ClassⅠ与ClassⅢ蛋白结构域较完整，除FtARF1、FtARF11、FtARF12、FtARF16和FtARF24缺少C端的Aux/IAA结构域外，其余蛋白均包含3个结构域。ClassⅡ中FtARF23蛋白结构域完整，FtARF9和FtARF17含有2个结构域。ClassⅣ中，所有蛋白均只含有B3结构域和Auxin_resp结构域。进一步对苦荞ARF蛋白保守基序分析，共鉴定了10个motif，其中FtARF19含有6个基序，FtARF11、FtARF12、FtARF16和FtARF22含有7个基序，FtARF9和FtARF15含有8个基序，FtARF24和FtARF26包含9个基序，其余蛋白均含有10个保守基序（图2）。

基因结构分析显示，26个FtARFs基因均含有外显子和内含子，不同苦荞ARF所含外显子数量差异很大，ClassⅠ成员的外显子数量差异较大，有10—15个，ClassⅡ成员的外显子数量为10—12个，ClassⅢ除个别基因含有7和15个外显子外，其余基因均含有14个外显子，ClassⅣ成员的外显子数量最少，为2—4个。这些结果暗示着FtARFs基因的结构差异可能影响着其功能的发挥，因此，有必要对该类基因进行进一步的功能分析。

2.3 不同植物ARF蛋白进化关系

为了充分揭示苦荞ARF基因家族的进化关系，选取拟南芥、水稻、甜荞、甜菜和大豆，6个物种共114个ARF蛋白构建系统进化树（图3）。聚类分析显示，共分为4个类群（GroupⅠ—GroupⅣ），分别含有38、15、38和23个成员，然而不同类群的蛋白在功能上可能存在一定差异，其中，苦荞FtARFs在4个类群中均有分布，如在GroupⅠ中包含8个成员（FtARF1、FtARF3、FtARF5、FtARF10、FtARF11、FtARF12、FtARF20和FtARF22），Group Ⅱ中包含3个成员（FtARF9、FtARF17和FtARF23），Group Ⅲ中包含10个成员（FtARF2、FtARF4、FtARF6、FtARF8、FtARF13、FtARF14、FtARF16、FtARF18、FtARF24和FtARF25），Group Ⅳ中包含5个成员（FtARF7、FtARF15、FtARF19、FtARF22和FtARF26）。同时发现有18个苦荞ARF成员与甜荞ARF高度同源。在Group Ⅰ中，拟南芥AtARF12—AtARF15、AtARF20— AtARF23成员单独聚在一个分支上，在其他5个物种中，均未发现与其高度同源的序列。

图1 FtARFs基因染色体分布图

图2 苦荞ARF家族的系统发育树、保守结构域和基因结构

图3 苦荞与其他物种ARF蛋白系统进化树

2.4 苦荞ARF基因的表达分析

为了解苦荞生长发育过程中ARF基因的表达变化，利用6个组织转录组数据的FPKM值绘制热图（图4），发现FtARFs基因具有组织特异性表达。其中，在成熟籽粒中特异表达，和在未成熟籽粒中表达量高，在成熟籽粒中表达量降低，且、和在聚类过程中高度同源，表明其可能在种子成熟发育过程中起重要作用。而另有7个基因在根中呈现高表达水平，这些基因可能参与根系发育及细胞伸长。但在叶中仅有3个基因特异表达，其余基因表达量都较低，可能是因为展开的叶片在促进细胞伸长方面要求较低。同时发现在花中基因表达量较高，有4个基因呈现表达差异。值得注意的是，、、、、、、、和在下胚轴中特异表达，暗示其可能与下胚轴伸长有关。

2.5 苦荞ARF基因家族启动子序列分析

利用在线网站PlantCARE预测9个下胚轴特异表达的FtARFs基因上游2 000 bp序列的顺式作用元件位点（图5），发现其具有多个激素响应元件，包括生长素响应元件、脱落酸响应元件、茉莉酸响应元件、水杨酸响应元件以及赤霉素响应元件。此外，该区域还发现一些其他胁迫响应元件，如光响应元件、干旱响应元件以及低温响应元件等。其中发现5个基因（、、、和）具有生长素响应元件TGA-element，而4个基因（、、和）启动子区域没有生长素响应元件。

2.6 IAA诱导下胚轴长度变异与FtARFs基因表达分析

FtARFs基因的启动子顺式作用元件预测结果表明多个FtARFs基因受生长素诱导。选取株高较高和较低材料各2份，经IAA处理后，2份矮秆材料的下胚轴1个被抑制（PI658429），1个被促进（PI647612），2份高秆材料下胚轴均伸长，但伸长趋势不一，ZNQ189伸长不明显（图6-A和图6-C）。对其下胚轴进行纵向切片并测量其细胞长度（图6-B和图6-D），结果显示，PI658429在生长素处理后细胞长度缩短0.4倍左右，其余3份材料在生长素处理后，细胞长度均伸长0.5倍以上，与幼苗表型变化相一致。

qRT-PCR检测IAA诱导下9个茎秆特异表达的FtARFs基因的相对表达量。结果显示（图7），在IAA处理前期（0.5—1 h），除、与外，其余基因表达水平均升高。在未经处理的材料中表达水平较高，而经IAA处理后，表达水平大幅下降，这可能是受到IAA抑制所引起的，并且在启动子元件分析中，该基因缺乏IAA响应元件也有印证。与之规律类似的还有，该基因在0.5 h处理点极短响应，随后即出现表达水平大幅降低，推测与缺乏生长素响应元件有关。

图4 苦荞ARF基因组织特异性表达

图5 苦荞ARF基因启动子元件分析

值得注意的是，PI658429在IAA处理后，下胚轴被明显抑制；相应地，所检测的FtARFs基因在处理0.5 h后都表现为表达量降低，推测可能是由于该品种无法响应持续的激素信号所引起的。PI647612和PI673849在IAA处理后，下胚轴呈现增长趋势（增幅为1 cm左右），在处理0.5 h后，分别有6个和7个基因表达量提高，其中PI673849材料中初期表达水平较低，随后表达水平持续升高，在6 h达到最高值，可部分解释该材料经IAA处理后呈现的下胚轴明显伸长的趋势。ZNQ189在IAA处理后，下胚轴增长但不明显，处理0.5 h时，基因表达差异不显著，在处理1和6 h时，和表达量都有一定的提高，说明这两个基因响应IAA的诱导。总之，不同材料对生长素响应不同，且大多数FtARFs基因受到IAA诱导，在处理初期（0.5—1 h）表达升高，处理后期表达降低。

3 讨论

近年来，从全基因组水平研究基因家族的分类、序列特点、进化特征和功能预测等已成为生物学分析的一种重要手段。ARF基因家族已被证明调控植物生长发育多个过程，具有重要的生物学功能[27]。

本研究鉴定的苦荞ARF蛋白多含有3个保守结构域，结构域之间的关联决定其功能。如，B3结构域可以与ARF基因启动子上的作用元件结合，通过Auxin_resp结构域激活或抑制相关基因的表达，ARF激活子可与Aux /IAA抑制子通过CTD结构域二聚化来抑制基因的表达[28]，而缺失的Aux/IAA结构域可能造成功能的多样化。系统进化是研究基因家族功能，预测基因功能的重要工具。由于苦荞分子生物学研究还处在起步期，因此，利用系统进化树对基因功能进行分类就显得尤为重要。本研究中的ARF蛋白聚为4类，该结果与梨[29]和葡萄[20]等研究结果一致，其中Class Ⅳ外显子数量明显少于其他类群，在苹果[30]、梨[29]等物种中也发现了类似现象,且FtARFs基因家族成员外显子数量为2—15个，与拟南芥[14]、葡萄[20]和番茄[18]相似。由此可见，ARF基因家族在结构进化上具有一定的保守性和一致性，这为其功能研究提供了参考依据。同时，对114个ARF蛋白的聚类结果深入分析发现，FtARF20与拟南芥AtARF1，FtARF1和FtARF5与AtARF2遗传距离接近，Ellis等[31]研究发现AtARF1和AtARF2主要调控叶片衰老、开花时间和种子大小等，预测苦荞中该类基因编码的蛋白可能具有类似功能。Feng等[32]研究发现，拟南芥AtARF11促进侧根形成，在激素信号途径中起关键作用，而FtARF12恰与其高度同源。同样，发现FtARF2、FtARF6、FtARF13与AtARF5聚为一类，预测其与极性生长及细胞扩增有关[33]。FtARF8、FtARF18、FtARF25与AtARF6聚为一类，Wu等[34]发现拟南芥AtARF6调控种子心皮发育，促进开花和果实成熟。FtARF14、FtARF24与AtARF19同源性较高，预测其能促进侧根的形成，在激素信号通路中发挥重要作用[35]。值得关注的是，AtARF8能调控下胚轴的伸长，并且是果实起始发育的负调控子[36]，本研究发现其同源基因和为下胚轴特异表达基因，表明极有可能调控下胚轴伸长，值得进一步研究。

A：生长素处理前后幼苗生长情况；B：生长素处理前后下胚轴细胞纵切图，黑色方框代表单个细胞大小；C：幼苗下胚轴长度变化；D：下胚轴细胞长度变化；图中*代表差异显著（P＜0.05），**代表差异极显著（P＜0.01）

A: PI658429, B: PI647612, C: ZNQ189, D: PI673849

作为最广泛的植物激素，生长素对植株的生长发育具有重要作用。Tiwari等[37-39]研究发现，生长素以浓度依赖的方式调节植物的生长发育。当生长素浓度低时，Aux/IAA抑制子与ARF转录因子相结合，抑制ARF的活性，当生长素浓度提高时，Aux/IAA被泛素化，ARF转录因子变为有活性的形式，激活或抑制下游基因的表达。Cheng等[40]发现拟南芥特定组织中生长素合成缺陷会造成突变体顶端优势丧失、株高下降、叶片扭曲等发育缺陷，对植株形态产生重要影响。同时，拟南芥受到外源生长素和乙烯的诱导，外源生长素浓度会影响的表达，从而影响介导的侧根形成[41]。可见，生长素的含量和分布对植株形态建成具有重要影响，因此，研究与生长素含量变化相关的基因，对解析植物生长发育具有指导作用。本研究使用0.5 mg·L-1IAA处理苦荞幼苗，不同的材料表现出不同的生长状态，PI658429下胚轴变短，其余材料下胚轴呈现出增长趋势，王红飞等[42]研究发现下胚轴伸长与细胞伸长直接相关，本研究对其下胚轴纵向切片发现，PI658429生长素处理后，细胞长度变短，其余材料细胞均伸长，因此推测4份材料在生长素处理后表现出不同的表型变化主要是由于细胞长度变化引起的。在生长素处理0.5 h时，大多数下胚轴特异表达的FtARFs基因表达量上调，在处理前期（0.5—1 h）表达量升高，处理后期表达量降低，盛慧等[43]使用生长素处理黄瓜幼苗发现，ARF基因的表达受到IAA的正调控。Liu等[25]对苦荞ARF研究发现在不同的组织和器官中，FtARFs基因的转录丰度变化很大，且具有组织特异性表达，外源NAA处理试验表明FtARFs基因在果实发育过程中对生长素正响应。同时WALLER等[44]也研究发现外源生长素在15—30 min内上调mRNA的稳态水平。因此，推测FtARFs基因在响应IAA信号诱导苦荞下胚轴伸长中发挥作用。但是发现虽然大多数FtARFs基因对外源生长素处理有反应，但生长素响应元件仅存在于其中5个FtARFs基因的启动子区，因此，FtARFs基因受生长素诱导的机制有待进一步阐明。

4 结论

鉴定出26个苦荞ARF家族基因，其具有组间多样性和组内保守性的特征，且FtARFs具有组织特异性表达，下胚轴长度变化与细胞长度变化相关，推测IAA可能调控苦荞下胚轴的伸长。

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Identification of ARF Gene Family and Expression Pattern Induced by Auxin in

HAO YanRong1, DU Wei1, HOU SiYu1, WANG DongHang1, FENG HongMei1, HAN YuanHuai1, ZHOU MeiLiang2, ZHANG KaiXuan2, LIU LongLong3, WANG JunZhen4, LI HongYing1, SUN ZhaoXia1

（1College of Agronomy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;3Center for Agricultural Genetic Resources Research, Shanxi Agricultural University, Taiyuan 030031;4Xichang Agricultural Institute of Liangshan, Xichang 615000, Sichuan）

【】The objective of this study is to lay a foundation for the further functional studies and application of ARF genes by identifying the ARF gene family in tartary buckwheat (), and analysis of gene structure, conserved domains, phylogeny, tissue expression characteristics, and gene expression levels under exogenous auxin treatment.【】The data of transcriptome and ARF conservative domains (PF06507) were analyzed to screen for ARF family members in tartary buckwheat. TBtools software was used to analyze the gene structure, NCBI and MEME were used to predict the conserved domain and motif of ARF proteins online, and MEGA X was used to construct ARF protein phylogenetic trees for tartary buckwheat,,,,,and. The FPKM values of six tissues of roots, stems, leaves, flowers, green grains, and black grains were analyzed in the transcriptome data of tartary buckwheat. Heat maps of FtARFs were drawn using TBtools HeatMap to analyze the tissue expression specificity of FtARFs. To predict the cis-acting elements of the FtARFs promoter specifically expressed on the stem, the PlantCARE online website was used. Two parts of tall buckwheat (ZNQ189 and PI673849) and two parts of dwarf buckwheat (PI658429 and PI647612) were treated with 0.5 mg·L-1IAA and the elongation characteristics of the hypocotyls were analyzed. Samples were taken at different time periods (0, 0.5, 1, 6, 12, 24, and 48 h) after auxin treatment, and the expression differences of FtARFs in different hypocotyls were analyzed by qRT-PCR. Moreover, paraffin sections of four materials grown for 7 days were saffron and green stained, and the cell length was measured.【】Total of 26 FtARFs were identified in the buckwheat genome. Chromosome mapping analysis showed that in addition to chromosome 4, FtARFs were distributed in other chromosomes. Analysis of physical and chemical properties showed thatamino acid residues ranged from 331 to 1 083 aa and the theoretical isoelectric point ranged from 5.34 to 8.63. Conserved motif analysis identified several differences in motif composition among different groups. Gene structure analysis showed that the number of FtARFs exons ranged from 2 to 15, showing large variation. Phylogenetic analysis showed that 114 ARF proteins were divided into four groups (Group Ⅰ to Group Ⅳ), and FtARFs were distributed throughout all groups. The results of tissue-specific analysis showed that FPKM values of FtARFs differed significantly in different tissues. In roots, stems, and flowers, seven, nine, and four genes showed high expression, respectively, whereas in leaves, green grains, and black grains, the expression values remained low. When exogenous auxin was applied to these four buckwheat materials, the trend of hypocotyl elongation differed, which is consistent with observed changes in cell length. qRT-PCR showed that the expression of FtARFs was higher during the early stage (0.5-1 h) of auxin treatment, and decreased during later stages. When buckwheat seedlings were treated for 0.5 h, the expression of most genes was induced.【】The tartary buckwheat ARF gene structures and protein motifs show diversity among groups and conservation within groups. FtARFs show tissue expression specificity, and nine FtARFs, that are specifically expressed in the stem, respond to IAA induction. These exert a regulatory role in the stem elongation of tartary buckwheat.

tartary buckwheat; ARF gene family; auxin; plant height; gene expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.23.002

2020-03-25；

2020-06-22

国家重点研发计划中欧政府间合作项目（2017YFE0117600）、山西省农业科学院应用基础研究计划（YGC2019FZ2）、国家燕荞麦产业体系（CARS-07-A-2）、山西省应用基础研究项目（201801D221296）、山西省回国留学人员科研资助项目（2017-069）、山西省研究生教育创新项目（2020SY211）、山西农业大学专业提升计划（TSJH1406）

郝彦蓉，Tel：19834543980；E-mail：1148639230@qq.com。通信作者孙朝霞，Tel：18636071356；E-mail：18636071356@163.com

（责任编辑 李莉）