基于LC-MS代谢组学技术的不同采收期黄芩叶化学成分比较研究

杨琳琳,柴建新,陈 强,秦雪梅,杜冠华,,周玉枝(山西大学中医药现代研究中心,太原 00006;山西振东制药股份有限公司;中国医学科学院药物研究所;通信作者,E-mail:zhouyuzhi@sxu.edu.cn)

黄芩叶(Scutellariabaicalensisleaves)是唇形科黄芩属植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的非药用部位,具有清热燥湿、泻火解毒、消炎、促消化之功效,其作为别样茶使用已有近千年历史[1],当地人常将黄芩叶采摘后晾干用水冲泡代茶饮用,发现其具有一定的保健作用。目前黄芩叶主要在民间使用,还未批准成为新食品原料,其加工工艺尚不成熟,黄芩叶茶质量良莠不齐,仍缺少规范的质量评价方法,黄芩药茶产业的发展及黄芩资源的进一步开发利用受到了制约。

黄芩叶的主要化学成分为黄酮类化合物,如野黄芩苷、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷等。目前大多数研究是采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)研究黄芩茎叶中化学成分。张雅蓉等[2]利用HPLC测定黄芩茎叶中的野黄芩苷含量。何春年等[3]利用HPLC-DAD发现黄芩茎叶中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等含量较低;而野黄芩苷、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷等成分含量相对较高。Liu等[4]通过HPLC-UV/MS对黄芩茎和叶中的黄酮类化合物进行了全面的研究。严宝飞等[5]基于UPLC-TQ-MS对不同产地黄芩茎叶中氨基酸类成分进行分析与评价,发现黄芩茎叶含有丰富的氨基酸类成分,不同产地间氨基酸种类几无差异,但含量差异较大;然后基于高效液相色谱-三重四极串联质谱联用技术对我国不同产地黄芩叶中15种化学成分(4种酚酸和11种黄酮类化合物)进行了比较分析[6]。有文献[7]报道,在传统药用部位根中含量较高的黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等成分在黄芩叶中含量较低,而在根中含量较低的野黄芩苷、芹菜素7-O-葡萄糖醛酸苷和异红花素-7-O-葡萄糖醛酸苷等在黄芩叶中含量较高。本实验采用代谢组学方法比较了不同采收期黄芩叶化学成分的整体差异,并对不同采收期黄芩叶中部分化学成分的相对含量进行了比较,为后期深入研究黄芩叶质量与科学地规定采收期提供借鉴,为黄芩叶批准成为新食品原料提供一定的参考。

然而,目前对于黄芩叶的研究只局限于野黄芩苷等少数几个黄酮类成分,对不同月份其他成分的变化研究较少。而基于LC-MS的代谢组学方法可以对黄芩叶的化学成分进行表征,且可以找到不同月份各成分之间的变化趋势,从整体上研究不同采收时间黄芩叶成分的差异。因此,本实验采用基于超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-QE-Orbitrap-MS)的代谢组学方法研究不同采收时间对黄芩叶化学成分的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

超高效液相色谱与质谱联用仪(Thermo Scientific Q Exactive LC-MS),美国Thermo公司;KQ5200E超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;十万分之一天平(德国赛得利斯集团);Xcalibur 3.2软件;Compound Discover 3.0软件;色谱柱:ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),十八烷基键合硅胶为填充剂,美国Waters公司;色谱乙腈(Fisher Scientific);色谱甲酸(Fisher Scientific)为色谱纯;纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

1.2 对照品及样品

不同采收期及不同生长年限的黄芩叶样品来源见表1,且经山西大学中医药现代研究中心实验室秦雪梅教授鉴定所有样品均为黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥叶。

表1 8批黄芩叶样本信息

黄芩苷(H-016-180309,质量分数≥98%)、黄芩素(H-018-180426,质量分数≥98%)、汉黄芩素(H-029-181216,质量分数≥98%)、野黄芩苷(Y-012-0171216,质量分数≥98%)对照品购自中国科学院成都生物研究所。

1.3 样品制备

精密称取不同生长年限不同月份采收的黄芩叶样品粉末各150 mg,置于50 ml具塞锥形瓶中,加入70%乙醇50 ml后称重,80 ℃超声提取1 h,再次称重,用70%乙醇补足减失重量,静置,过滤。取续滤液,用0.22 μm微孔滤膜过滤,即得。所有检测样品均平行备样6份。另取上述测试样品各600 μl混合,用于质量控制(QC)样品,每10针样品进样结束后进一针QC样本及空白甲醇样本,用于检测仪器的稳定性[8]。

1.4 色谱条件

采用ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色谱柱。流动相:A为乙腈,B为0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱程序:0-3 min,15%-23% A;3-7 min,23%-25% A;7-9 min,25%-27% A;9-11 min,27%-50% A;11-14 min,50%-52% A;14-15 min,52%-90% A;15-17 min,90% A;17-17.5 min,90%-15% A;17.5-20 min,15% A;流速0.30 ml/min,柱温40 ℃,样品池温度15 ℃,进样量3 μl。

1.5 质谱条件

采用电喷雾离子源的正负离子检测模式,亮氨酸脑啡肽作为校正溶液,采用full MS(resolution 35 000)和MS/MS(resolution 17 500),质量扫描范围100-1 500 Da,锥孔电压40 V,毛细管电压3.0 kV,离子源温度120 ℃,脱溶剂气温度300 ℃,脱溶剂气体流速600 L/h,锥孔气体流量50 L/h,碰撞能量50-80 V。

1.6 数据处理

将采集得到的黄芩叶样品原始数据导入公司自带Compound Discoverer(CD,美国Thermo Scientific)软件进行前处理,利用Xcalibur3.0(美国Thermo Scientific)软件查看质谱图,并用CD软件导出质谱矩阵数据,得到的代谢物的分子量(molecular weight,MW)、保留时间(retention time,RT)、碎片离子等信息与标准品、在线数据库(如Chemspider、Mzcloud、HMDB等)进行化合物的匹配与鉴定。

将CD软件导出的归一化后的峰面积分别导入SIMCA-P 13.0(Umetrics,umeå,Sweden)软件进行多元统计分析,包括无监督主成分分析(principal components analysis,PCA),有监督的偏最小二乘法判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)和正交偏最小二乘法(orthogonal projections to latent structures discrimination analysis,OPLS)等,同时使用独立的t检验和单向方差分析(SPSS 16.0;IBM Corporation,Armonk,NY,USA)对数据进行分析,P<0.05被认为差异有统计学意义,对同一年限不同月份的代谢物数据进行两两比较,分别找出不同年限不同采收期黄芩叶的差异代谢物。然后运用Origin(8.0,OriginLab,USA)软件对不同年限不同采收期差异代谢物的相对含量分别进行分析,最后采用MetaboAnalyst 3.0进行差异代谢物间的相对含量相关性分析(correlation analysis)。

2 结果

2.1 黄芩叶的化学成分指认

通过比较两个不同生长年限的不同采收期黄芩叶UPLC-MS/MS总离子流图,可直观发现不同采收期黄芩叶中的化学成分种类基本相同,而含量有所差异。图1为黄芩叶总离子流图,由于黄芩叶在负离子模式下通过CD软件导出获得的化合物灵敏度较高,因此本研究采用负离子模式进行分析。结合文献[4,8-13]、标准品和数据库,根据UHPLC-MS/MS矩阵中的保留时间、质荷比及碎片离子等信息对黄芩叶中的代谢产物进行指认,共推断出58个代谢产物(见表2),其中红花素-7-O-葡萄糖醛酸苷(16)、野黄芩苷(17)、异红花素-7-O-葡萄糖醛酸苷(19)、聚酯型儿茶素A(23)、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(24)为黄芩叶中的主要成分。

2.2 基于LC-MS代谢组学的不同采收期黄芩叶差异代谢物分析

利用SIMCA-P 13.0软件对预处理后的数据进行PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析,并通过载荷图和以变量投影重要性(VIP值)大于1、统计学差异小于0.05为阈值,筛选并鉴定差异代谢物。PCA分析的得分散点图能从整体上观察各组的分离情况,直观地显示不同样品之间的整体差异。

化合物1-58信息见表2图1 LC-MS/MS负离子模式下的黄芩叶样本基峰离子图Figure 1 Base peak current chromatogram in negative ion mode of Scutellaria baicalensis leaves by LC-MS/MS

表2 通过UHPLC-MS/MS在黄芩叶指认出的化合物信息 (未完待续)

续表2 通过UHPLC-MS/MS在黄芩叶指认出的化合物信息 (未完待续)

续表2 通过UHPLC-MS/MS在黄芩叶指认出的化合物信息

图2A和图2B分别为一年生和两年生不同采收期黄芩叶的PCA散点图,图中QC样本紧密聚集,证明采用的样品处理方法和仪器分析方法稳定。不同采收期黄芩叶各聚一类,明显分离。PCA作为一种反映原始数据状态的无监督方法,环境等其他因素以及系统错误都会影响实验结果。为排除由与实验无关的某些因素引起的代谢变化,并获得更准确的结果,本研究使用有监督的PLS-DA分析对数据进行进一步处理,确定潜在的差异成分。PLS-DA分析着重强调组间的差异,通过拟合度(R2Y)和预测度(Q2)对模型准确性进行评价,一般R2Y值较大,Q2>0.5表明该模型较好。本实验的PLS-DA模型一年生样本R2Y=0.999,Q2=0.999,两年生样本R2Y=0.996,Q2=0.993。随后进行置换检验,用于验证PLS-DA模型的拟合程度,Q2截距值小于或等于0,表明模型有效,可以进行后续的差异成分寻找。图2C和图2D为模型验证图,由图可知本研究所用模型有效,不存在过拟合现象,可用于进行组间差异成分的寻找及分析。图2E和图2F分别是一年和两年生不同采收期样本OPLS-DA分析对应的载荷图。基于UHPLC-MS/MS数据,用载荷图确定对分类有显著贡献的变量,规格化方法为Par,在一年生和两年生样本中指认出的差异代谢物(VIP值>1)各有28个,且均为化合物1,2,3,5,6,11,12,14,15,16,17,19,22,23,24,25,26,27,28,29,31,33,34,36,37,40,44,56。

PC1为描述多维数据矩阵中最显著的特性;PC2为除PC1以外的所能描述多维数据矩阵中最显著的特性图2 黄芩叶在不同采收期的多元统计分析图Figure 2 Multivariate statistical analysis charts of Scutellaria baicalensis leaves in different harvest periods

2.3 差异代谢物含量的变化趋势

从图3,4可看出一年生和两年生黄芩叶含量变化趋势一致的有12个,其中化合物17,23,24,25随着月份的增加,含量逐渐降低,5月份含量最高;化合物12,26随着月份的增加,含量先升高后降低,6月份含量最高;化合物19,27,37随着月份的增加,含量变化较大,6月份含量最高;化合物29在7月份含量最高;化合物1和5在8月份含量最高。另外,还有6个化合物31,34,36,40,44,56,虽然它们在一年生和两年生中变化规律不一致,但它们在两年生黄芩叶中8月份含量较高,而在一年生黄芩叶中7月份含量较高;化合物3和6虽然在一年生和两年生中变化规律不一致,但它们在两年生黄芩叶中7月份含量较高,而在一年生黄芩叶中8月份含量较高;此外,化合物2,16,22,28在一年生和两年生中黄芩叶5月份和6月份含量较高。而剩余差异代谢物11,14,15,33一年生和两年生含量变化规律性不强。

2.4 差异代谢物的相关分析

使用MetaboAnalyst 3.0对不同采收期黄芩叶的差异代谢物的相关性进行分析,分别计算同一年限差异代谢物的Pearson相关系数,并以相关矩阵的形式作聚类相关系数图,其中红色表示正相关,绿色表示负相关,颜色越红或者越绿表示相关性越大,反之越小。

图3 黄芩叶在不同采收期差异代谢物的相对含量变化Figure 3 The relative contents of differential metabolites of different harvest periods of Scutellaria baicalensis leaves

图4 黄芩叶在不同采收期差异代谢物的相对含量变化Figure 4 The relative contents of differential metabolites of different harvest periods of Scutellaria baicalensis leaves

相关性分析结果显示,一年生样本中化合物11,14,15,16,17,19,22,24,25,28聚为一类,两年生样本中化合物11,12,14,15,22,28,29聚为一类,这些化合物各自在一年生和两年生中呈正相关,表明以上化合物相对含量变化趋势相似,颜色越红代表相关性越强,变化趋势越相近,且以上化合物均为含有4′-OH基团的黄酮类成分,说明化学结构相似的化合物在生物体内有较强的相关性(见图5)。一年生和两年生样本中化合物31,34,36,40,44,56均分别聚为一类,呈正相关,且均为无4′-OH基团的黄酮类成分,并与有4′-OH基团的黄酮类成分呈负相关,表明这两类化合物相对含量变化趋势相反,颜色越绿代表相关性越强,变化趋势相反的程度越大。以上结果表明在黄芩叶生长发育过程中相似化学结构成分的变化规律一致,这可能与它们具有相似的生物合成途径有关。有文献[14,15]报道黄芩中黄酮类化合物的积累是有器官特异性的,根中黄酮类化合物的主要类型是不含有4′-OH基团的,而地上部分(叶和花)黄酮类化合物主要是含有4′-OH基团的,这与黄芩不同生长部位中黄酮类化合物的合成途径不同有关。

图5 不同采收期差异代谢物之间相关系数的聚类分析Figure 5 Cluster analysis of the correlation coefficient between differential metabolites in different harvest periods

3 讨论与展望

黄芩叶作为别样茶已有近千年的历史,过去的研究主要集中在野黄芩苷等少数几个黄酮类成分,对不同月份化学成分差异的系统性研究较少。本研究利用代谢组学技术对黄芩叶组分进行综合性评价,研究结果表明,黄芩叶中差异代谢物的相对含量随着生长月份和生长年限的不同而发生不同的变化,并遵循一定的规律。Li等[16]总结发现有效成分即药用植物中次生代谢产物的含量和组成随生长季节、生长年限和环境的变化而变化。Guo等[17]发现不同种类的生态因子对黄芩次生代谢产物的影响程度不同。由此推测本实验中不同采收期黄芩叶的差异代谢物的相对含量和动态变化趋势与黄芩叶生长季节年限等因素相关。茶叶的采摘期与茶叶的品质密切相关[18],由于春季雨水充沛,气温适宜,经过一个冬季的休眠,根部积累了充足的养分,使得嫩芽叶色泽翠绿,叶质柔软,氨基酸等含量较高,口感极佳。之后随采摘期的延后,叶中主要成分含量有所下降。本实验研究发现L-谷氨酰胺(2)、夏佛塔苷(12)、红花素-7-O-葡萄糖醛酸苷(16)、野黄芩苷(17)、异红花素-7-O-葡萄糖醛酸苷(19)、异高山芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷(22)、聚酯型儿茶素A(23)、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(24)、柚皮素-7-O-葡萄糖醛酸苷(25)、5,7,2′-三羟基-6-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷(26)、5,7,2′,6′-四羟基黄烷酮(27)、异高山芩素-8-O-葡萄糖醛酸苷(28)等在5-6月含量较高,其中红花素-7-O-葡萄糖醛酸苷(16)、野黄芩苷(17)、异红花素-7-O-葡萄糖醛酸苷(19)、聚酯型儿茶素A(23)、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(24)为黄芩叶中的主要成分;而L-谷氨酰胺(1)、D-葡萄糖二酸(3)、柠檬酸(6)、黄芩苷(31)、二氢黄芩苷(34)、去甲汉黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷(36)、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷(40)、松属素-7-O-葡萄糖醛酸苷(44)、白杨素(56)等在7-8月份含量较高。结合以上规律,若以含有4′-OH基团的黄酮类成分为目标成分,则建议采收期为5-6月;若以不含有4′-OH基团的黄酮类成分为目标成分,则建议采收期为7-8月。后期应对这两类成分的生物活性进行深入研究,以确定黄芩叶的最佳采收期。但由于本研究样本采摘局限于同一产地,研究结果只能反映这一产地的化学组分差异,存在一定的局限性,同时也要考虑叶片的采摘对药用部位根质量的影响。

综上,本实验利用代谢组学方法比较了不同采收期黄芩叶的质量,为后期深入研究黄芩叶质量与科学地规定采收时期提供参考和借鉴,同时为建立规范合理的黄芩叶质量标准,加强对黄芩叶的质量监控及黄芩叶资源开发应用和药茶的发展提供理论依据。