乌梢蛇实时荧光定量PCR法的建立及与普通PCR鉴别方法的比较研究

杨宝，朱殿龙，马宁，张烨，李忠华

(1.太原市食品药品检验所分子生物学检测室，山西 太原 030006；2.大连市检验检测认证技术服务中心中药检测室，辽宁 大连 116000；3.山西省食品药品检验所食品检测室，山西 太原 030006)

乌梢蛇为游蛇科动物乌梢蛇的干燥体。多于夏秋二季捕捉。剖开腹部或先剥皮留头尾，除去内脏，盘成圆盘状，干燥[1]。乌梢蛇始载于《开宝本草》，原名“乌蛇”,别名剑脊乌梢蛇。其性味甘平，归肝经；有祛风、通络、止痉的作用[2]。

近年来，由于资源有限，价格昂贵，市售常见的蛇药材均普遍地存在着伪品和混淆品现象，如非药用价值的蛇冒充有药用价值蛇类,或中药材蛇类之间存在的混淆现象，特别是炮制后，除去了头、鳞、骨，更易混杂，这给临床用药的安全及药物的质量和疗效带来潜在危险[3]。此外，药材在加工处理剖去内脏后，要进行干燥熏黑处理，皮上的花纹特征、颜色几近消失，难以辨认，而且其大小、形态特征与乌梢蛇也有所差异，这是造成其性状鉴别困难的另一重要原因。近年来DNA 分子鉴别技术快速发展，位点特异性PCR、DNA 测序等技术开始用于动物类药材的鉴别，多种动物药材已建立分子鉴别方法[4-10]。《中国药典》2015年版鉴别项下增加了乌梢蛇PCR鉴定，但由于药典所载方法用时较长，方法步骤较多，所需的检验仪器设备也较多，因此无法满足中药真伪鉴别现场运用的需要。本研究基于乌梢蛇CO1 片段的SNP位点序列特征，设计特异性引物、探针，通过PCR能快速准确地鉴别乌梢蛇。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品 通过对市场流通的乌梢蛇药材调查，发现市场上多以红点锦蛇(Elapherufodorsata)、黑眉锦蛇(Elaphetaeniura)、玉斑锦蛇(Elapheman-darinu)、王锦蛇(Elaphecarinata)、灰鼠蛇(Ptyaskorros)、滑鼠蛇(Ptyasmucosus)、赤链蛇(Dinodonrufozonatum)、赤链华游蛇(Sinonatrixannularis)等来假冒乌梢蛇药材进行销售，这与陈瑞生等[2，11-12]的论文结果是一致的。

本试验共采集乌梢蛇药材及其易混伪品15个物种30份样本，覆盖市场上常见伪品，样品分别采集于河北安国、安徽亳州，以及太原市药店，广州清远，大连、桂林市药品检验所。样品经大连市药检所朱殿龙副主任中药师鉴定，凭证样本保存于太原市食品药品检验所，样品信息见表1。

1.1.2 仪器 香港力康Neofuge13R高速冷冻离心机；美国热电ABI7500fast荧光定量PCR仪；BIO-RAD C1000 TOUCH梯度PCR仪、Power Pac Basic电泳仪、凝胶成像系统，均购自美国伯乐公司。

1.1.3 试剂 DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products试剂盒(Tkara9178)；引物、探针由上海生工生物公司合成；ABI TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(2X)购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样本DNA提取方法比较 取供试品，用75%酒精棉球擦拭消毒，干燥，用球磨仪粉碎成细粉状。

表1 样本信息表

表2 所需仪器设备数量比较

用Eppendorf微量核酸分析仪测定 DNA的纯度，将OD260/OD280在1.7～1.9之间，且浓度范围在10～100 ng·μL-1的DNA溶液作为模板DNA，-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物的设计与扩增 引物设计：检索NCBI的数据库和采用测序后获得乌梢蛇及鼠蛇科近源物种灰鼠蛇、滑鼠蛇等样品相关序列数十条，首先用Snap gene软件比对出保守序列，再经过Oligov7.0.1和NCBI的 Primer-Blast，设计出能够用于乌梢蛇真伪鉴别多个特异性位点的实时荧光PCR检测引物和探针，由上海生工生物公司合成，具体见表3～4。

表3 实时荧光PCR检测引物和探针

表4 样本DNA提取过程比较

本试验反应体系配制如下表5，药典扩增体系配制严格按照药典方法配制。

表5 扩增反应体系

本试验方法扩增反应条件与《中国药典》检验方法比较如下表6。

1.2.3 特异性试验 以“1.2.1”项下Takara9178核酸提取试剂盒方法提取的乌梢蛇为标准品药材(121591-201602)，以金环蛇、银环蛇(4批)、赤链蛇(2批)、赤练华游蛇(2批)、蕲蛇(3批)、黑眉锦蛇(2批)、虎斑游蛇、玉斑锦蛇、滑鼠蛇、王锦蛇、草蛇、灰鼠蛇、红点锦蛇、渔游蛇，共计3科12属15个物种样品DNA 为模板，按上述体系和反应条件进行实时荧光PCR条件扩增，并设空白对照，验证引物和探针的特异性。

1.2.4 样品覆盖度试验 将一批新鲜乌梢蛇样品(WSS007)，3批乌梢蛇中药材未炮制样品(WSS001-003)，3批乌梢蛇炮制品(WSS004-006)上述3种样品按照“1.2.1”项下Takara9178核酸提取试剂盒方法提取样品DNA，分别进行“1.2.2”项下实时荧光PCR条件扩增，进行结果分析。

1.2.5 灵敏度 将100 ng的(WSS001)乌梢蛇DNA模板10倍递减稀释，稀释至1×10-3ng每个梯度做5个平行试验，分别进行“1.2.2”项下实时荧光PCR扩增和现行药典方法扩增电泳，进行结果分析，测试该方法的灵敏度。

2 结果与分析

2.1 本研究检测方法与现行药典检测方法比较 如表2所示，《中国药典》规定电泳产物分析应单独设立扩增产物分析区，避免有毒有害物质传播和试验过程交叉污染，需要电泳设备及凝胶成像设备，因此，现行药典方法无法应用于快检车。本研究检测方法所需仪器设备较少，采用便携式仪器更能够节省使用空间，整个检测过程全部为闭管操作无须电泳检测直接得出结果，该方法可灵活应用于快检车内。

如表4和表6，本研究检测方法得出结果仅需要40 min～1 h左右，现行药典检测方法检测时间大约需要3.5～4 h左右，本研究检测方法比中国药典检测方法快2.5～3 h，能够达到快速检验的目的。

2.2 特异性试验 如图1所示，除中检院乌梢蛇对照药材CT值小于35，在35个循环内产生明显的对数扩增曲线以外，其余非乌梢蛇类样品CT值均大于35，蕲蛇、滑鼠蛇、银环蛇、赤链蛇在35至40个循环有不同程度的扩增曲线，根据试验结果，本试验判定阳性结果应定为CT值小于35。

2.3 样品覆盖度试验 如图2所示，将市场上采集的7批样品分别提取DNA，每组样品做两个平行，分别进行实时荧光PCR扩增，7批乌梢蛇样品CT值小于35，在35个循环内可产生对数扩增曲线，乌梢蛇鲜制品比干制品小4个左右CT，干制品比炮制后干制品小4个CT左右。

2.4 灵敏度试验 如图3所示，当乌梢蛇DNA 反应每管含量为100 ng 时，平均CT=14.27；含量为10 ng 时，平均CT =17.77； 当含量为1 ng，平均CT=21.37；当含量为1×10-1ng时，平均CT=24.85； 当含量为1×10-2ng时，平均CT=28.37； 当含量为1×10-3ng时，平均CT=32.19，CT值均小于35，本方法灵敏度高达1×10-3ng，浓度梯度间各浓度的平均CT差为3.56，相对标准偏差RSD均小于3.5%，扩增结果具有良好的重复性。以稀释度对CT值作图，其线性关系如图4所示，线性相关系数R2=1，线性方程为Y=-3.557lgX+14.231，线性范围为 1×10-3～100 ng即(0.001%～100%)，该方法有良好的线性相关性。

如图5所示药典方法灵敏度仅能达到1×10-2ng/反应，并且在该浓度下电泳结果通过肉眼已很难判读，本研究检测方法的灵敏度1×10-3ng/反应，灵敏度比现行药典检测方法高10倍。

图1 乌梢蛇特异性扩增图谱

图2 乌梢蛇样品覆盖度扩增图谱

图3 实时荧光PCR灵敏度试验结果

图4 实时荧光PCR灵敏度标准曲线

图5 扩增电泳方法灵敏度试验

3 结论与讨论

近年来，随着分子生物学技术的发展，各种分子标记技术纷纷被应用于乌梢蛇的鉴别中。《中国药典》2015年版中收录了乌梢蛇分子生物学鉴别方法。陈康等[13]通过对经典PCR 技术方法条件进行优化，将PCR技术与荧光检测技术结合应用到蛇类药材真伪鉴别。李梓僮等[14]结合现代 DNA 指纹图谱技术，对《中国药典》2015年版乌梢蛇 DNA 检测方法进行了优化和改良，开发了乌梢蛇 PCR 检测试剂盒。但这几种检测方法均为普通PCR法，仅具有引物单重特异性，而市场上中药材种类繁多，物种基因存在多样性，检测过程易出现假阳性的结果，且这些方法灵敏度相对较低，对于深加工及中成药类等DNA含量较低的样品，可能出现假阴性结果的风险。孙清萍等[15]通过环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)开发出一套快速筛查乌梢蛇正品的方法。该方法虽然快速，特异性强，但不能参与多重检测反应，若产生引物二聚体，易产生假阳性结果。

本研究针对蕲蛇、滑鼠蛇、银环蛇、赤链蛇在35至40个循环有不同程度的扩增曲线，这种扩增结果可能是由于中药材本身存在痕量物质的污染或者扩增程序在35个循环后存在交叉反应导致的，因此为了降低待测物种的假阳性率，本研究在市售易掺伪3科12属15个物种样品特异性试验的基础上，将CT值35作为目标物种阳性判定分界点，特异引物和探针对目标物种和非目标物种在35以上无交叉反应，痕量物质对试验结果无影响。覆盖度试验结果显示乌梢蛇鲜制品CT值<乌梢蛇未炮制干制品<炮制后乌梢蛇干制品，说明乌梢蛇样品在经过干制和炮制后，样品DNA均会有不同程度的降解，DNA提取难度也相应地增加，但本研究的方法仍能够检出目标基因。从引物、探针的灵敏度试验可以看出，该方法在1×10-3ng DNA含量时仍能有良好的重复性，因此以该方法分析乌梢蛇DNA的检出限为1×10-3ng/反应，而如图4所示《中国药典》检测方法检出限为1×10-2ng/反应，所以本方法有更高的灵敏度。

通过引物和探针与模板的特异性杂交来鉴别模板的实时荧光PCR检测方法特异性更高；并且采用完全闭管检测，无须PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性；整个试验所需仪器设备较少，从提取到获得结果仅需40 min到1 h，而药典方法需要3.5～4 h，需要的检验检测设备也较多。综上，实时荧光PCR技术，由于采用仪器检测器检测扩增反应的荧光，放大了反应信号，由仪器判读试验结果，灵敏度较高，因此能够应用于乌梢蛇及其饮片现场快速检测中。