响应面法优化酸枣仁苦荞酸奶发酵工艺

李华，倪娜，赵汝，王华

（内蒙古民族大学，内蒙古通辽028000）

0 引 言

酸枣仁，是鼠李科植物酸枣经干燥后的成熟种子，富含油性物质气味微淡[1-2]。近年很多学者研究认为黄酮类物质是酸枣仁中重要的活性物质之一，其具有抗氧化、镇静催眠等多种功效[3-4]。 苦荞，蓼科作物，苦荞中含有丰富的黄酮类等化合物，使它不仅可以降血糖、降血脂，同时还具有清除自由基、抗菌、抗癌等功效[5-8]。

本研究对酸枣仁、苦荞进行预处理后将其用于酸奶发酵中，使产品除具有酸奶本身维持肠道菌群健康、提高免疫力等保健功能外，还具有清除自由基、抗氧化等保健功能，以迎合现代消费者对风味、营养及保健功能完美结合的需求。此外，产品的研发也体现了药食同源资源在食品中的综合利用，同时为酸奶产品多样化及功能性酸奶市场的扩大提供理论基础。

1 实 验

1.1 材料与试剂

酸枣仁（生），市售；苦荞，市售；牛奶，市售；蔗糖，市售；德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus Bugarska）、嗜热链球菌（Termofilski Streptococcus）为内蒙古民族大学食品科学与工程实验室提供。

乙醇（95%），磷酸（98%），无水乙醇，氢氧化钠，亚硝酸钠，硝酸铝均为AR，天津市大茂化学试剂厂；芦丁，南京奥多福尼生物科技有限公司；考马斯亮蓝G-250，天津市天力化学试剂有限公司；牛血清白蛋白，BSA Bovine Serum；总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)，Beyotime。

1.2 仪器设备

高速多功能摇摆粉碎机（XTP-500A），浙江永康市红太阳机电有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9203A），上海精宏实验设备有限公司；紫外可见分光光度计（UV-5500PC），上海元析仪器有限公司；恒温培养箱（DNP-9272），上海精宏实验设备有限公司；高速台式冷冻离心机（TGL-16M），长沙湘智离心机仪器有限公司。

1.3 工艺流程

1.3 操作要点

1.3.1 酸枣仁苦荞浆的制备

用高速粉碎机将酸枣仁进行粉碎后过60 目筛，与水按1∶7 混合后煎煮1.5 h，冷却后过滤，滤液备用。苦荞发芽后以嫩茎、嫩叶为原料，经干燥、粉碎后过60目筛，与水按1∶5 混合后糊化酶解得苦荞浆。根据前期预实验的结果将二者以2∶1 的比例混合均匀，4 ℃贮藏备用。

1.3.2 菌种驯化

将均质后的鲜牛奶冷却至42 ℃左右，按照鲜牛奶∶乳酸菌（Lactobncillus bulgaricus∶Streptococcus thermophilus=1∶1)的接菌量为150 mL∶1 g的比例添加乳酸菌，置恒温培养箱内42 ℃，发酵7 h后4 ℃ 冷藏，留以备用[9]。

1.3.3 配料混匀

将均质后的牛奶和酸枣仁苦荞浆混合均匀，按比例加入白砂糖，冷却温度至42 ℃左右接驯化后的菌种，充分搅拌。

1.4 酸枣仁苦荞酸奶感官评定

根据GB19302-2010（食品安全国家标准发酵乳）[10]设计酸枣仁苦荞酸奶的感官评分标准（百分计）如表1 所示。由15 名人员（无感冒，身体状态良好，无不良嗜好）组成感官评定小组，将适量的酸奶盛装于容器中，在光线充足的环境下观察酸枣仁苦荞酸奶颜色，闻酸奶的气味，然后用纯净水多次漱口，最后品尝滋味，根据表1 对编号的样品进行感官评分，求其平均值作为最终得分并记录。

1.5 酸枣仁苦荞酸奶中黄酮质量分数的测定

根据食品中总黄酮的测定分光光度法（SZDB/Z 349-2019）[11]配制标准溶液与样品，使用分光光度计（波长λ为510 nm），分别测定标准溶液与样品的吸光度值A，以黄酮浓度为横坐标，以吸光度A 为纵坐标制作黄酮标准工作曲线，并得到回归方程，代入黄酮计算式（1）计算得出酸枣仁苦荞酸奶中黄酮质量分数，即

式中：ω为黄酮质量分数（mg/100g）；m1为根据标准曲线得到的黄酮质量（mg）；V 为试样的提取体积（mL）；V1为吸取试样的体积（mL）；M 为试样的质量（g）。

1.6 产品理化及微生物指标测定方法

酸度的测定按GB5009.239-2016 中的酸度滴定法执行[12]；

蛋白质的测定按GB 5009.5-2010 中的凯氏定氮法执行[13]；

脂肪的测定按GB 5413.3-2010 中盖勃氏法测定脂肪含量[14]。

同时采用试剂盒测定产品的总抗氧化活性，并以市售普通酸奶做比较。

1.7 酸枣仁苦荞酸奶单因素发酵工艺优化

本研究对影响酸枣仁苦荞酸奶品质的4 个发酵工艺参数白砂糖添加量、乳酸菌接菌量、酸枣仁苦荞浆添加量及发酵时间分别进行单因素试验变量研究。分别考察白砂糖添加量（7%，8%，9%，10%，11%）；乳酸菌接菌量（2%，3%，4%，5%，6%）；酸枣仁苦荞浆添加量（10%，15%，20%，25%，30%）和发酵时间（5，6，7，8，9 h）对酸枣仁苦荞酸奶品质的影响，并经感官评定以确定各单因素的最佳参数。

1.8 响应面法优化酸枣仁苦荞酸奶发酵工艺

根据Box-Behnken 中心组合试验设计原理，在单因素试验基础上采用四因素三水平的响应面分析方法分别分析酸枣仁苦荞酸奶发酵工艺条件与产品感官品质之间的关系，试验设计因素及水平如表2所示。

表1 酸枣仁苦荞酸奶评分标准

表2 发酵工艺条件优化响应面实验设计

2 结果与分析

2.1 白砂糖不同添加量对产品感官品质的影响

白砂糖在酸奶中即可以影响酸奶的甜度调节改善酸奶风味同时也影响乳酸菌的发酵，适宜的添加量可以促进乳酸菌的发酵，添加量过高或过低都会抑制乳酸菌的发酵[15-16]。取适量均质后的牛奶，添加4%驯化后的乳酸菌接菌和15%的酸枣仁苦荞浆，再分别以7%，8%，9%，10%，11%的添加量添加白砂糖，混合均匀经42 ℃发酵7 h 后4 ℃后熟得产品，并对产品进行感官评价，其结果如图1所示。

图1 白砂糖添加量对酸枣仁苦荞酸奶品质的影响

由图1 可以看出，当白砂糖添加量由6%到10%时，感官评分值先增大后减小的趋势，当白砂糖的添加量为9%时，感官评分值最高可达84.8，酸度为72.2 °T，此时口感柔和细腻，酸甜适中，故白砂糖的最佳添加量为9%。

2.2 酸枣仁苦荞浆不同添加量对产品感官品质的影响

添加4%驯化后的乳酸菌和质量分数9%的白砂糖，再分别以质量分数10%，15%，20%，25%，30%的添加量添加酸枣仁苦荞浆，混合均匀经42 ℃发酵7 h 后4 ℃后熟得产品，并对产品进行感官评价，其结果如图2所示。

图2 酸枣仁苦荞浆添加量对酸枣仁苦荞酸奶品质的影响

由图2 可知，预处理后的酸枣仁苦荞浆的颜色为藕荷色，酸枣仁苦荞浆的添加量在10%～25%范围时会影响酸奶的风味和色泽。酸枣仁苦荞浆的添加量较少时，酸奶会呈现其本身的颜色，且产品只有奶香而不具有酸枣仁的典型芳香气味和苦荞的麦香；酸枣仁苦荞浆添加较高时，会抑制乳酸菌的发酵，使发酵时间延长，且酸奶颜色较深且酸枣仁的味道完全掩盖了酸奶本身的风味。因此，当添加酸枣仁苦荞浆的量在20%时感官评分最高，可达85.5 分，牛奶酸度76°T，此时酸奶呈现出淡藕荷色，有奶香、酸枣仁的芳香和苦荞的麦香，口感细腻，酸甜较适口，无乳清析出。

2.3 乳酸菌不同接菌量对产品感官品质的影响

酸奶发酵生产中，嗜热链球菌（Termofilski Streptococcus）有利于提高酸奶酸度，缩短发酵时间；德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus Bugarska）发酵产物影响酸奶的风味[17]。在发酵过程中黄酮可能会影响乳酸菌的发酵，在发酵初期黄酮溶出速度较快，为避免黄酮类物质对乳酸菌发酵的影响故本试验将二种菌种以1∶1 比例进行复合[18-19]。复合菌种接菌量较大或较小对酸奶发酵及产品感官都是非常不利的，接菌量较大会导致酸奶发酵速度过快，产酸较多，酸甜感不协调，且后熟过程中乳清析出较多；接菌量太少，酸奶发酵时间较长，产酸不足的同时也会使酸奶产生异味。取适量均质后的牛奶添加9%白砂糖和20%酸枣仁苦荞浆，分别以2%、3%、4%、5%、6%的接菌量接菌，混合均匀经42 ℃发酵7 h 后4 ℃后熟得产品，并对产品进行感官评价，其结果如图3所示。

图3 乳酸菌接菌量对酸枣仁苦荞酸奶品质的影响

由图3 可知，当接菌量在2%～6%时，感官评分呈现先增大后减小的变化趋势，与此同时随着接菌量的增大酸奶酸度呈增大的趋势。综合感官评分和酸度，确定酸枣仁苦荞酸奶的乳酸菌最佳接菌量为4%，此时感官评分为87.2 分，酸度为78 °T，产品组织细腻呈淡藕荷色，具有奶香、酸枣仁的芳香和苦荞的麦香，口感酸甜适中，且无乳清析出。

2.4 不同发酵时间对产品感官品质的影响

酸奶发酵时间的长短会影响发酵过程中各类生物化学反应的发生程度进而影响产品的感官品质。取适量均质后的牛奶添加9%白砂糖和20%酸枣仁苦荞浆，以4%接菌量接菌，混合均匀经42 ℃分别发酵5，6，7，8，9 h 后4 ℃后熟得产品，并对产品进行感官评价，其结果如图4所示。

图4 发酵时间对酸枣仁苦荞酸奶品质的影响

由图4 可知，感官评分会随发酵时间的延长呈现先升高后降低的变化趋势。发酵时间在5～7 h 时，随发酵时间延长发酵越充分，质地就越均匀，口感细腻柔和，当发酵7 h 时感官评分最高可达90.7 分，酸度为80 °T；当发酵时间大于7 h 后，酸奶的口感就会有所下降，口感较为细腻，酸度大于80 °T，此时酸奶口感较酸，且随发酵时间的延长酸度越来越大，酸甜比例失调。因此当发酵7 h 时，酸枣仁苦荞酸奶质地均匀，润滑爽口，酸甜感最佳，具有独特的酸枣仁芳香和苦荞的麦香。

2.5 响应面法优化酸枣仁苦荞酸奶发酵工艺

2.5.1 优化发酵工艺的响应面试验及方差分析

通过Design-Expert8.0 软件进行表2 二次响应面回归分析，得到如下多元二次响应面回归模型：

Y=-718.34167 + 84.82A + 61.52B + 11.014C +47.62667D-1.875AB-0.34AC-0.85AD+0.31BC+0.425BD+0.02CD-3.51917A2-5.93167B2-0.20827 C2-2.96917D2。

由表 4 可以看出：B，C，A2，B2，C2，D2对酸枣仁苦荞酸奶感官品质的影响极显著，A 和、AB 对酸枣仁苦荞酸奶感官品质有显著影响，影响酸枣仁苦荞酸奶感官品质的因素先后顺序为接菌量＞酸枣仁苦荞浆添加量＞白砂糖添加量＞发酵时间。总体分析，回归模型P＜0.001，表明该模型极显著；同时，回归模型的失拟项不显著（P＞0.05），R2Adj= 95.21 %，说明95.21%的数据都可以用这个二次方程解释。

2.5.2 两因素交互作用影响发酵工艺的响应面分析

做出响应曲面，分析白砂糖添加量（A），接菌量（B），酸枣仁苦荞浆添加量（C）和发酵时间（D）对酸枣仁苦荞酸奶感官品质的影响，结果如图5 所示。

响应面图可以评价白砂糖添加量、接菌量、酸枣仁苦荞浆添加量和发酵时间之间的交互作用及对酸枣仁苦荞酸奶感官品质的影响，由响应面图可知曲面有极大值，工艺的最优配方在实验范围内，等高线图近似于椭圆形，说明各因不交互作用较为显著，这与表4显著性分析结果一致。

2.5.3 验证实验

以酸枣仁苦荞酸奶的感官品质评分为最终优化值，经Design-Expert8.0 软件预测可得最佳发酵工艺为：白砂糖添加量8%，接菌量5%，酸枣仁苦荞浆添加量20%，42 ℃下发酵7 h 后4 ℃下冷藏后熟，产品感官评分预测值为92.4 分。为了检验回归模型预测的可靠性，在预测条件下重复3 次实验，得到产品的平均感官评分为92.8 分，测定值与预测值之间的相对误差为0.4%，与预测值基本一致。此时产品呈淡藕荷色，质地均匀，口感细腻，无乳清析出，有酸乳的香气、酸枣仁的芳香及苦荞的麦香。

表3 优化发酵工艺Box-Behnken响应面实验设计与结果

图5 白砂糖添加量、接菌量及交互作用对感官评分的响应面和等高线

表4 发酵工艺优化方差分析

图6 白砂糖添加量、酸枣仁苦荞浆添加量及交互作用对感官评分的响应面和等高线

对产品理化性质及黄酮含量进行了测定，参考国标GB19302-2010《食品安全国家标准发酵乳》的各项指标进行评定，结果如表5所示。由表5可以得出，酸枣仁苦荞酸奶各项理化指标均符合国标，且产品中由于添加了药食同源的酸枣仁、荞麦浆而含有黄酮（6.89±0.02）mg/100g，总抗氧化能力（1.019±0.002）mmol/g。

图7 白砂糖添加量、发酵时间及交互作用对感官评分的响应面和等高线

图8 接菌量、酸枣仁苦荞浆添加量及交互作用对感官评分的响应面和等高线

3 结 论

图9 接菌量、发酵时间及交互作用对感官评分的响应面和等高线

图10 酸枣仁苦荞浆添加量、发酵时间及交互作用对感官评分的响应面和等高线

表5 理化指标及黄酮质量分数测定

本文通过Box-Behnken 中心组合试验设计原理，在单因素实验基础上采用四因素三水平的响应面分析方法分别分析酸枣仁苦荞酸奶发酵工艺条件与产品感官品质之间的关系，确定酸枣仁苦荞酸奶的最佳发酵工艺为：白砂糖添加量8%，接菌量5%，酸枣仁苦荞浆添加量20%，42 ℃下发酵7 h 后4 ℃下冷藏后熟得到的产品呈淡藕荷色，质地均匀，口感细腻，乳清析出少，有酸乳的香气及酸枣仁的芳香。经测定，酸乳各项理化指标符合GB19302-2010《食品安全国家标准发酵乳》的各项指标，且黄酮质量分数为（6.89±0.02）mg/100g，抗氧化能力（1.019 ± 0.002）mmol/g，说明酸枣仁及苦荞中的黄酮部分保留在了发酵酸乳中。这为药食两用作物酸枣仁及苦荞在保健食品中的进一步开发应用提供借鉴。