储藏期内转Bt基因稻谷对印度谷螟生长发育的影响

吴学友，陈二虎，王康旭，唐培安

（南京财经大学 食品科学与工程学院，粮食储运国家工程实验室，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏 南京 210023）

害虫为害是制约稻谷粮食安全的主要威胁之一，与传统农业中的化学药剂防治相比，转 Bt基因水稻抗虫杀虫受到研究者的青睐[1-3]。转 Bt基因水稻的靶标害虫主要是农田害虫，然而籽粒中存在Bt蛋白，转基因稻谷的杀虫特性在储藏期间也会对储粮害虫产生影响，将导致粮仓生态系统发生变化，进而影响储藏期的稻谷品质[4-5]。印度谷螟Plodia interpunctella（Hübner），隶属于鳞翅目卷螟科，是世界性的仓储害虫之一，其幼虫喜剥蚀粮食子粒的胚部和表皮，吐丝结网造成粮食结块变质，其成虫善飞，易造成储粮的重复感染[6-8]。因此，开展储藏期内转基因稻谷对储粮害虫印度谷螟生长发育的影响对加深稻谷安全储藏认知具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试稻谷

转基因稻谷华恢1号：以pBluescript II KS(+/–)phagemid为载体，通过基因枪法介导，将抗虫基因Cry1Ab/Cry1Ac导入水稻明恢63获得转Bt基因抗虫水稻，标记为HH/Bt（图1-1）。非转基因稻谷明恢63：转Cry1Ab/Cry1Ac基因水稻华恢1号的非转基因亲本对照，标记为MH/CK（图1-2）。上述两种稻谷由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室提供。

图1 -1 转Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷（HH/Bt）

图1 -2 非转基因亲本（MH/CK）

1.2 供试虫源

印度谷螟采自南京财经大学储粮害虫防控实验室的模拟粮仓中，后在养虫室内人工饲养数代。将印度谷螟配对成虫接种于含有100 g人工饲料的玻璃瓶中（经160 ℃干热灭菌），产卵24 h后移出成虫，挑取新鲜卵粒置于培养小室（Φ30 mm×15 mm），添加适量人工饲料（大豆粉和酵母粉按质量比20∶1混合而成）。饲养条件为（27±1）℃、75%±5% RH、24 h无光照。

1.3 主要仪器设备

JLGJ4.5型检验砻谷机：浙江台州市粮仪厂；FW80型高速粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；SL1202N型分析天平：Denver公司；PQX-300D型人工气候箱：宁波东南仪器有限公司；SZM45型体式显微镜：宁波舜宇仪器设备有限公司。

1.4 稻谷饲料样品配制

稻谷HH/Bt和MH/CK样品分别经除杂，砻谷、再除杂，粉碎等处理后获得MH/CK、HH/Bt糙米粉，随后向HH/Bt糙米粉中添加MH/CK以制备HH/Bt含量分别为80%、50%、20%、10%、5%和2%的混合糙米粉，以MH/CK（0%）、HH/Bt（100%）糙米粉分别作为阴性对照和阳性对照。

1.5 试虫处理

取新羽化的印度谷螟成虫 30只（雌雄比为1∶1），产卵后在卵粒周围添加适量配制好的稻谷饲料，置于养虫室（75% RH，24 h无光照）。每24 h观察一次，记录卵的孵化数、虫龄、死亡数和羽化数等信息。待试虫成虫羽化后，立即进行雌雄配对，单对观察并统计产卵数及成虫寿命。模拟温度为：21、24、30、33、36和39 ℃，每个处理200头重复，对照组饲料为MH/CK糙米粉。

1.6 发育速率与温度关系模拟

印度谷螟各虫态生长发育速率与温度的关系曲线模拟依据Briere等[9]推导的非线性模型进行，并利用SPSS19.0统计软件进行回归方程拟合，计算印度谷螟生长发育各虫态发育参数（a、T0、TL），并确定印度谷螟各虫态的发育速率与温度关系的非线性模型。

Briere等[9]推导的昆虫种群生长发育速率与温度关系的非线性模型为：

其中，R(T)表示平均发育速率，是昆虫某一虫态发育所需时间的倒数，单位为d–1；T表示温度，T0表示最低发育温度，TL表示最高发育温度，单位均为℃，在计算之初，可以根据实验观察予以推测大概范围；a表示经验常数，某一昆虫种群各虫态的a值在一定范围内。依据上述非线性模型方程。

1.7 数据处理

所有实验均设置 3个生物学重复，数据采用SPSS19.0软件进行方差分析，通过独立样本t测验比较分析转基因稻谷对印度谷螟发育的影响，实验数据均为平均值±标准误表示，显著差异水平设置为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 转基因稻谷对印度谷螟的致死效应

以不同含量转基因稻谷糙米粉饲喂印度谷螟初孵幼虫，观察记录1至3龄幼虫生物学特性以及存活情况。研究发现，印度谷螟初孵幼虫即开始取食，对含HH/Bt的饲料并无明显的趋避行为表现，这一发现与已有报道相一致[10-11]。幼虫在取食含转基因稻谷的饲料后中毒表现为：首先离开饲料，随之其运动能力减弱，粪便含水状物，其腹部有明显凹陷，皱缩，身体蜷缩，干瘪发黄，最后死亡。由此可见，转Bt基因稻谷对印度谷螟的致死效果，这一研究结果与此前报道类似[10-11]。

致死率统计结果显示，转Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷对印度谷螟低龄幼虫（1至 3龄幼虫）具有较强的致死效应[10-11]，在HH/Bt含量高于20%时，初孵1龄幼虫在尚未进入2龄期就已经全部死亡。在2%和5%HH/Bt含量时，幼虫在3龄结束进入 4龄时的死亡率分别为 60.0%和 68.3%（详见表1）。因此，本研究选取2% HH/Bt作为实验组饲料来探讨转Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷对印度谷螟生长发育的影响。

2.2 转基因稻谷对印度谷螟发育历期的影响

在模拟 21～36 ℃试验温范围内，转Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷对印度谷螟的生长发育均有显著影响，且整体上呈现发育历期延长的趋势，这一结果与先前研究报道一致[10-11]。在 27 ℃条件下，对照组（MH/CK）试虫卵至成虫的发育历期为63.20 d，2% HH/Bt糙米粉饲喂的实验组试虫延长为75.60 d。各发育阶段试虫的发育历期为：对照组一龄、二龄、三龄和四龄幼虫发育历期均约为5 d左右，而实验组则均延长为8 d左右；对照组五龄幼虫发育历期为 7.55 d，实验组则延长为10.22 d；研究还发现，六龄幼虫发育历期缩短，对照组为16.47 d，实验组则缩短为12.83 d；化蛹后，对照组蛹期和成虫期的发育历期分别为 8.21和 7.06 d，实验组蛹期和成虫期的发育历期则分别延长为9.06和8.50 d（表2）。

根据C. de A. E. Gasparin提出的有效积温法则，作为变温动物的昆虫，其生长发育须从外界（食物和环境）获取一定的热量，且存在发育阈温度和最适发育温度。不同模拟温度条件下，取食MH/CK和2% HH/Bt糙米粉的印度谷螟卵发育至成虫所需总时间见图2。在21～36 ℃条件下，对照组和实验组试虫均能完成生长发育，对照组和实验组均在 30 ℃条件下发育历期达到最小值（分别为53.00 d和67.73 d）。统计分析结果表明，以2% HH/Bt和MH/CK糙米为饲料的印度谷螟在各温度下发育历期差异均极显著（P<0.05）。

表1 不同含量的转基因稻谷对印度谷螟的致死率统计 %

表2 不同温度下转Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷对印度谷螟生长发育的影响

图2 转Bt基因稻谷对印度谷螟生长发育（卵至成虫）的影响

2.3 各虫态发育速率与温度关系的模拟

昆虫的生长发育不但需要在一定的温度范围内，且在这个适宜昆虫生长发育的温度阈值内，昆虫的生长发育速度同样受到温度的影响。印度谷螟各虫态生长发育速率表明，其生长发育速率与温度的关系是非线性的，在21～30 ℃其趋势为类似对数增长，在高于 30 ℃之后，该曲线迅速下降，在最高发育速度的两侧曲线并不对称。依据 Briere等[9]非线性模型进行回归方程拟合，印度谷螟生长发育速率与温度关系模型参数如表 3所示：印度谷螟的发育起点温度（T0）为 7.40～15.94 ℃，其中，卵、六龄期、蛹的起始温度分别为15.15、9.92和7.40 ℃，表明印度谷螟六龄幼虫和蛹对低温的耐受能力很强；印度谷螟发育最高温度（TL）在 37.60～44.11 ℃，其中，卵孵化的温度上限为 38.71 ℃，本研究在 39 ℃下的印度谷螟卵未能发育也证实了这一推断结果。各虫态的发育速率R(T)与温度T间的拟合非线性曲线模型见图3。

表3 印度谷螟生长发育速率与温度关系模型参数

2.4 转Bt基因稻谷对印度谷螟发育速率的影响

印度谷螟各虫态发育速率与温度关系的非线性方程各参数见表4。以2% HH/Bt糙米粉为食的印度谷螟发育起点温度（T0）为4.90～17.36 ℃，其中卵孵化的起始温度为 15.13 ℃，六龄幼虫和蛹对低温的耐受能力最强；发育最高温度（TL）上限为 37.72～40.33 ℃，其中卵孵化的温度上限为38.96 ℃。据此推断，印度谷螟在转Bt基因稻谷为饲料的生长环境中的适应性要高于对照组，与先前转基因稻谷对鳞翅目仓储害虫生长发育影响结果相同[12-14]。2% HH/Bt糙米粉饲喂印度谷螟各虫态发育速率R(T)与温度T间的拟合非线性曲线模型见图4。

图3 印度谷螟各虫态发育速率与温度关系模拟

表4 印度谷螟生长发育速率与温度关系模型参数（2% HH/Bt）

通过以上表3与表4数据以及印度谷螟各虫态3个参数对比研究发现，取食转Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷并没有显著改变印度谷螟最高发育温度，但印度谷螟各虫态发育最低温度有所增加，这可能是低温和Bt蛋白双重作用的结果。

转Bt基因稻谷的开发是抵抗田间害虫的有效手段[15-18]，同时转基因稻谷的产后面临的仓储环节引起诸多粮食储藏研究人员的诸多关注。赵文娟[10]用转Cry1Ac+SCK稻谷饲喂印度谷螟的研究表明实验组印度谷螟存活率、发育历期分别为40.8%、62.2 d，而对照组分别为75.2%、53.0 d，两者存在显著差异。蒋海燕等[11]通过配制不同比例转Bt基因稻谷人工饲料测定其对1～3龄幼虫在72 h内的急性毒力实验表明，取食含10%、30%、50%和70%转基因稻谷粉饲料72 h后的印度谷螟初孵化幼虫的死亡率分别为 29.30%、48.50%、54.75%和71.61%。转基因稻谷开发时，尽管选取的Bt基因有所不同，但获得的转基因稻谷对鳞翅目昆虫据均有良好杀灭作用，本文以及类似研究均表明，转基因稻谷对鳞翅目储粮害虫仍表现出良好的抗虫性。

图4 印度谷螟各虫态发育速率与温度关系模拟（2% HH/Bt）

目前关于转Bt基因稻谷对储粮害虫生长发育的研究表明，转Bt基因抗虫稻谷对印度谷螟、麦蛾和米蛾等鳞翅目害虫显示出较高的抗虫性，在存活率、发育历期等生物学指标上与对照组都存在差异性。Mcgaughey[19]首次报道了印度谷螟在实验室条件下对Bt产生抗性。稻谷的储藏是一个长期持续的过程，在Bt蛋白的长期胁迫下，将导致害虫种群中抗性基因及个体的出现或增加，严重的甚至会出现“超级害虫”，这是一个重要的生态安全问题，粮库害虫管理将面临新的挑战。为此，我们还对喂食转基因稻谷后的印度谷螟差异表达基因以及抗氧化酶活性进行研究[20-21]，这对于加强储粮害虫抗性管理及抗性风险预测，为转基因稻谷的安全储藏提供指导，是十分必要且有意义的。

3 结论

利用转Bt基因稻谷糙米粉（HH/Bt）饲养印度谷螟，统计不同温度条件下各虫态的发育历期和发育速度，并与非转基因稻谷糙米粉（MH/CK）饲养的对照组进行比较分析，得到如下结论：

（1）温度能够显著影响印度谷螟各虫态的发育历期和发育速度，印度谷螟各虫态生长发育速率R（T）与温度T的非线性模型拟合曲线显示，该虫发育起点温度（T0）为7.40～15.94 ℃，其中，卵孵化的起始温度和最高温度分别为 15.15 ℃、38.71 ℃。

（2）将印度谷螟卵接入到完全转Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷的饲料中，孵化的幼虫全部死亡，这表明储藏期内转Bt基因稻谷对粮仓印度谷螟具有一定的致死作用。

（3）以转Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷（2%HH/Bt）饲喂的印度谷螟幼虫生长发育所需时间比对照稻谷（MH/CK）显著增加，说明在亚致死剂量以下时，Bt蛋白可以减缓印度谷螟生长发育速率。

（4）取食含转Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷饲料的印度谷螟发育起点温度（T0）为4.90～17.36 ℃，温度范围较对照组有所扩大，而卵孵化的起始温度和最高温度则分别为 15.13 ℃、38.96 ℃，无明显变化。

备注：本文的彩色图表可从本刊官网（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中国知网、万方、维普、超星等数据库下载获取。