脂联素对急性呼吸窘迫综合征大鼠炎性因子及细胞凋亡因子的影响

王春亚，马琪，张娜，裴斐

作者单位：西安交通大学第二附属医院，a心血管外科，b重症医学科，c病理科，陕西 西安710004

急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）是临床常见急危重症之一，多继发于严重感染、休克、创伤等疾病过程中，其主要发病机制为各种病因继发炎症反应导致肺毛细血管内皮和肺泡上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，引起急性呼吸功能障碍［1］。近年来，随着分子生物学的不断进展，细胞凋亡在ARDS的发病过程中所起的作用日益受到重视，故干预细胞凋亡可能是治疗ARDS的新手段和方式，值得更进一步深入探讨。脂联素（Adiponectin，APN）是一种由脂肪细胞分泌的蛋白质激素，具有抗炎、抗动脉粥样硬化、增加胰岛素敏感性等多种生物效应。以往的研究发现APN可通过多种机制发挥抗炎作用，达到肺保护作用。但APN是否通过改变ARDS的细胞凋亡来影响病情发展，国内外鲜有报道。本课题于2018年1—12月拟针对这一方面展开深入研究。

1 材料与方法

1.1材料雄性Wistar大鼠45只，体质量范围为150～200 g，周龄范围为6～7周，购于第四军医大学实验动物中心，动物许可证号SCXK（陕）2014-002。鼠基因重组APN购于Biovision公司（CA.USA）；细菌内毒素（Lipopolysaccharide，LPS）购于美国Sigema公司；检测肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor a，TNF-α）和白细胞介素-10（Interleukin 10，IL-10）的Elisa试剂盒及检测凋亡因子的蛋白质印迹法（Western Blot）试剂盒均购于杭州联科生物技术股份有限公司。

1.2方法选用同种同窝Wistar雄性大鼠45只，采用随机数字表法分为三组，分别为对照组、LPS组和APN组。制备模型前禁食不禁水12 h，LPS组：经腹腔注射LPS 7.5 mg/kg，APN组：造模前12 h经腹腔注射鼠重组 APN 6 mg/kg［2］，对照组：经腹腔注射等量的0.9%氯化钠溶液。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.3标本采集与指标测定

1.3.1 血标本采集 造模12 h后，用10%水合氯醛0.35 mL/100 g对大鼠进行腹腔麻醉，用器械分离组织，暴露心脏，用5 mL注射器穿刺采血5 mL，缓慢注入含有10%乙二胺四乙酸（EDTA）的干燥试管中，立即摇匀，2 000 r/min，离心20 min，取上清液置于-80℃超低温冰箱冻存待测。

1.3.2 肺组织的采集 游离出左下肺，取部分肺组织，经甲醛固定后，脱水、石蜡包埋切片，采用苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察各组肺组织病理学变化；剩余左肺下叶组织标本用磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗3次，按照1 mL/100 mg的比例将肺组织加入PBS中，使用电动匀浆机制成匀浆，以4℃，12 000 r/min离心后取上清，置于-80℃冻存备用。

1.3.3 血浆和肺组织中 TNF-α、IL-10的测定 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组大鼠造模后12 h血浆中TNF-α、IL-10，其方法严格按照试剂盒说明书步骤操作。

1.3.4 肺组织中B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）蛋白相对含量测定 采用蛋白质印迹法测定。提取肺组织中总蛋白质，以牛血清白蛋白作为标准曲线，BCA法测定蛋白浓度，常规电泳转膜，封闭后分别加入Bax、Bcl-2、Caspase-3抗体或β-肌动蛋白（β-actin）抗体4℃轻摇过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶抗体标记二抗，化学发光试剂增强反应X线压片曝光，将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。以Bax、Bcl-2、Caspase-3或 β-actin条带的吸光面积积分比值来评定蛋白表达水平。

1.4统计学方法采用SPSS 23.0统计软件包进行统计分析，连续变量（非正态分布资料）采用中位数（下、上四分位数）［M（P25，P75）］进行描述，多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，对差异有统计学意义（P＜0.05）的指标进一步进行多组间两两比较，以P＜0.016 7为差异有统计学意义。

2 结果

2.1三组大鼠血浆中TNF-α、IL-10水平比较APN组和LPS组的TNF-α及IL-10水平均高于对照组，而低于LPS组（P＜0.016 7）。见表1。

2.2三组大鼠肺组织中TNF-α、IL-10水平比较APN组和LPS组的TNF-α及IL-10水平均高于对照组，而低于LPS组（P＜0.016 7）。见表2。

2.3各组大鼠肺组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达水平比较LPS组和APN组的三种蛋白水平均高于对照组（P＜0.016 7）；APN组的Bcl-2高于LPS组，Caspase-3低于LPS组（P＜0.016 7），而Bax水平两组间差异无统计学意义（P＞0.016 7）。见表3。

表3 三组大鼠肺组织中B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）蛋白水平比较/M（P25，P75）

2.4三组大鼠肺组织病理改变光镜下，对照组大鼠肺组织结构正常，肺泡形态完整，肺间质结构清晰；LPS组肺泡组织结构不清，间隔明显增厚，间质充血水肿明显，肺泡腔内有大量中性粒细胞浸润，可见不同程度的塌陷及肺不张；APN干预组肺间质充血、水肿程度较模型组减轻，肺泡腔内炎症细胞浸润减少。见图1。

3 讨论

近年来，尽管ARDS的基础研究及临床诊治取得长足发展，但其病死率仍可高达35%～40%，值得密切关注［3］。目前关于ARDS的发病机制有多种学说，其中最主要的为炎症反应学说，当各种病因诱发失控性炎症反应时，会引起血管内皮细胞及肺泡上皮细胞的通透性增加，继而各种炎症细胞及富含蛋白的水肿液，进入肺泡腔及肺间质，最终导致呼吸衰竭［4-5］。参与ARDS发病的炎性介质中，影响最大的是TNF-α和白细胞介素。TNF-α是炎症反应级联中至关重要的始动因子，主要由巨噬细胞分泌，可增强中性粒细胞的吞噬能力，并且上调ICAM-1的表达，激发中性粒细胞释放更多炎性因子［6］。白介素包括促炎因子和抗炎因子，IL-10作为人体内重要的抗炎因子，可抑制炎症反应，重建炎症反应和抗炎反应的平衡。研究发现因ARDS死亡病人的疾病初期，其肺泡灌洗液中的IL-10水平较低，推测IL-10不足可能是导致促炎因子生成增多以及肺内炎症反应加剧的原因之一［7］。本研究采用LPS腹腔注射造模的肺组织病理切片提示与对照组相比，模型组肺组织的炎症反应明显加重。进一步将对照组和LPS组大鼠相关炎性指标进行对比，结果发现无论是肺组织还是血浆中TNF-α和IL-10水平，LPS组均高于对照组，说明促炎因子水平增加时，机体内的抗炎因子水平也会相应增加，来维持机体促炎反应与抗炎反应的平衡。

APN是一种具有抗炎效应的细胞因子，可通过多种机制下调IL-6、TNF-α等促炎因子水平，上调抗炎因子水平［8-9］，并能直接与细菌脂多糖相结合来改善炎症反应，减轻靶器官损害程度。APN与ARDS发病有一定相关关系，Jason M Konter等［10］发现经气道滴入脂多糖，APN-/-组小鼠的肺损伤程度及炎症反应均重于对照组，而动物实验证明外源性补充APN可减轻ARDS及炎症反应性疾病的严重程度，并改善预后［11］。本实验APN组在ARDS造模前12h经腹腔注射APN，其病理结果发现，经APN干预的大鼠肺组织损伤程度相较于LPS组明显减轻，且肺组织和血浆中TNF-α和IL-10水平均明显低于LPS组，说明减轻炎症反应是APN控制肺组织损伤的机制之一，这与之前的研究结果相似。

除了炎症反应机制，近年来细胞异常凋亡在ARDS的发病过程中所起的作用日益受到重视。目前认为有三类细胞的凋亡与ARDS发病密切相关，包括多形核粒细胞（Polymorpho-nuclear leukocyte，PMN）、肺泡上皮细胞及肺血管内皮细胞，其中最主要的是PMN细胞。该细胞是机体防御外来病原体的第一道防线，具有非特异性防御功能，在机体发生ADRS时，PMN被过度激活，并释放大量炎性介质、活性氧自由基、蛋白水解酶等，导致组织及器官的损伤，因此其适时凋亡对减轻组织损伤具有重要意义。但研究发现，ARDS早期，PMN凋亡延迟，同时伴有内皮细胞和肺泡上皮细胞凋亡增强，凋亡通路的失衡可能在ARDS发病过程中发挥重要作用［12］。目前研究较多的与ARDS相关的凋亡因子，包括抑凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax及Caspase-3［13］。Bcl-2是一种主要分布于核膜、线粒体外膜和内质网膜的膜结合蛋白，可以通过多种途径参与细胞凋亡过程，是多种细胞凋亡调节的关键性因子，其高表达往往可以阻止正常细胞的凋亡程序的启动，从而延长细胞寿命［14］。在ARDS急性期，Bcl-2呈现低表达，导致病情加重［15］。Bax定位于细胞质，属于Bcl-2家族成员之一，转染Bax不仅能引起许多细胞自发凋亡，而且能够促进多种因素引起的多种细胞凋亡。Bax与Bcl-2具有一定同源性，可形成一对具有双向调节作用的异型二聚体，其比例决定了细胞生存还是凋亡［16-17］。Guinee等［13］的研究发现，在弥漫性肺泡损伤的病人中，其肺组织Bax蛋白的表达显著性增高，提示Bax的高表达与急性肺损伤密切相关。Caspase-3是Caspase酶系家族中的重要一员，是凋亡通路的关键执行者，可通过多个途径来参与ARDS的发生发展。有研究发现在急性胰腺炎肺损伤中，Capase-3蛋白酶表达早期即可出现升高，表明急性肺损伤与Caspase-3蛋白表达升高有着密切关联［18-19］。多种凋亡因子的共同作用决定着ARDS的发生发展。故此干预细胞凋亡可能是治疗ARDS的新手段和方式。本研究将三组大鼠肺组织中的抑凋亡因子Bcl-2，和促凋亡因子Caspase-3及Bax进行比较，结果发现APN组的Bcl-2表达高于LPS组，而Caspase-3表达均低于LPS组，说明APN通过对凋亡因子调控来达到肺保护作用。然而本实验仅发现这一现象，但APN具体是通过哪些途径来调控凋亡因子的水平并不清楚，未来拟通过进一步研究来阐明其中的机制。

综上所述，APN不仅通过抑制炎症反应降低ARDS大鼠的肺部损伤程度，还可能通过影响组织细胞凋亡来达到肺保护作用。

（本文图1见插图12-1）