应用于文物保护的生物技术述略

冯正腾

一、前言

文物见证历史，历经较长时间，在环境中受到很多因素影响，会产生多种病害，如有机质文物（纸张、皮革、布匹等）的霉斑、黏连、前人的不当修复、糟朽、褪色等；石质文物的开裂、表面形成黑色的硬壳、风化现象等；竹木漆器类文物饱水、开裂、降解等[1]。

适当的预防及抢救保护方法可以延长文物的“寿命”。随着科技发展，文物保护理念及技术手段也在不断积累经验和创新，目前的文物保护手段多以物理和化学方法为主。不恰当的修复手段会导致严重的后果，犹如摸着石头过河。微生物在文物上生存会形成有一定稳定性的生态系统，某些微生物对文物的破坏会占主导地位，如果这个生态系统被破坏，则会形成新的平衡[2]。拉斯科岩洞自1940年被发现以来经历了数次生物病害危机，专家们采取过多次的保护措施，但洞内壁画多年来却受到不同的微生物污染，平衡状态十分不稳定[3]。

生物技术是新兴的综合性学科，可以为文物保护工作提供更多参考，生物学反应特异，有针对性，对文物、操作人员和环境安全，是可持续发展的绿色策略。其应用包括多个方面的内容：生物检测——检测文物病害类型，厘清病害的产生机理；生物杀灭——运用天然成分杀灭有害细菌、真菌、昆虫等；生物清洗——利用微生物代谢反应或微生物产物特异地去除文物表面的污染物，而不损伤文物表面有价值的信息；生物加固——运用微生物及其产物进行文物加固保护处理等。

二、文物的生物学检测技术应用

（一）文物的生物病害

空气中漂浮着大量的生物颗粒，以生物气溶胶形式传播扩散，会对人体及文物产生不良影响。生物气溶胶由生物活动产生，由微生物或其他生物活性分子构成，包括空气中的细菌、尘螨、真菌、病毒、花粉、孢子等，是固态或液态的颗粒，在大气中的数量密度在30%左右。气溶胶里的细菌会在石质、壁画、木质、纸质、纺织品等文物表里产酸、产酶、分解纤维素及蛋白质、染色、形成生物膜；真菌、藻类、地衣、苔藓等会深入石质、木质文物基体，产生裂缝，产酸、染色；昆虫及植物也会侵蚀文物，产酸及造成结构破坏等。

文物储存的室内环境，或古迹建筑本身，受自身结构和材料、空调、照明系统、人员流动、所在地气候等影响，可成为微生物繁殖的良好基质，微生物沉积繁殖，同时也对人体有影响，微生物侵染繁殖的主要参数之一是温湿度[4][5]。

文物的一些病害如有色斑点、降解、腐蚀、孔洞等可以通过生物学方法检测成因及状态，方法包括显微镜法、分子生物学法、生物化学法等。通过这些方法，可以先清楚引发文物病害的源头，若是生物病害，则先鉴定有害微生物，认识其理化性质，再选用适当的方法去除。

鉴别微生物的方法有培养法和免培养法，培养法是收集文物上的微生物样本进行培养，观察菌落形态特征、培养特性，如其生长适宜温度及生长速率等，再分离优势菌株，通过基因测序分析其种属，从而提高文物保护工作的针对性[6]。

然而实验室可以培养的微生物仅占自然界种类的1%，从文物中分离培养的微生物或不能准确反映文物中的微生物情况，针对这点，可选用免培养法对文物中的微生物进行检测。

（二）扫描电子显微镜分析法

用扫描电镜观测文物的微生物病害是免培养法，方法快速、直观，能观察到样品的细胞水平。杨娟[7]检测画作表面的剥落，发现其中有霉菌菌丝、孢子的结构，即使画作表面没有看到菌斑，也能判断其已受霉菌侵蚀。在南海I号沉船船体发掘过程中，船木表面附着了白色污染物，通过扫描电镜观察，分辨出有细胞结构的霉菌和析出的盐分，通过木材样品切片镜检，可以看到真菌菌丝已经侵入到木射线中[8]。在小白礁I号沉船的保护工作中，通过扫描电镜可以看到木质文物的腐蚀状况，侵蚀细菌的类型，细菌的附着位置，并能了解其部分生理生化特征[9]。

（三）分子生物学方法

分子生物学检测快速、方便、精确，且优势越来越明显。分子生物学法是基于基因水平的检测，所用的方法包括或涉及聚合酶链式反应（PCR,Polymerase Chain Reaction)、变性梯度凝胶电泳（DGGE,denatu ring gradient gel electrophoresis)、高通量测序法（highthroughput sequencing）等。

PCR-DGGE法是PCR和DGGE的联用，通过扩增微生物特征DNA（16sDNA、18SDNA、ITS等）中的一些片段，根据不同种属DNA片段的分子量和电荷比的差异在凝胶电泳上将之分离，通过其条带及亮度可得到待测样品微生物群落组成。高通量测序法是一种DNA边合成边测序的手段，且随着发展，DNA的读长在不断增长[10]，读出DNA序列后可通过比对基因库，得出样品中各微生物的种属，能得到样品微生物的多样性和丰度等参数，有助于研究群落内部及群落与环境间的关系等。

重庆三峡博物馆[11]用沉降法采集空气微生物，提取总DNA进行PCR-DGGE检测，选取优势菌种测序，得出微生物数量与季节变化相关。颜菲等[12]在云冈石窟及石窟周边岩石取样进行PCR-DGGE检测，选取优势条带进行测序，发现有些细菌会参与磷、硫、氮、碳循环，可分解空气中的污染物，会在文物表面产酸，腐蚀石质文物。Kusumi等人[13]采集了柬埔寨吴哥窟巴扬寺砂岩石质建筑表面的有色生物膜样品，及建筑物空气中的微生物样品进行PCR-DGGE检测，发现空气中微生物种类比建筑表面的少得多，采集的生物膜干湿、颜色、厚度各不相同，微生物的成分也有不同，微生物之间有寄生关系。

Michaelsen等人[14]检测一份13世纪纸质手稿的病害，用DGGE法及克隆文库法检测了真菌和细菌菌落的组成，电子显微镜和电子分散光谱观察分析无机成分，得出手稿上有真菌干燥的菌丝、孢子、淀粉、纤维素、含铁油墨、海盐等成分，推测出手稿的保存过程中环境温湿度有变化，曾因湿润而导致细菌侵染繁殖，后又经历干燥或盐渍环境，导致适应该条件的微生物繁殖。

DGGE方法灵活方便，但也有局限性，跟高通量测序方法相比，DGGE法反映的物种丰度或将被高估，而多样性或将被低估[15]。高通量测序法相比DGGE更直观、更准确，但成本相对较高。对比两份不同团队[16] [17]做的南海I号沉船的木材微生物高通量测序检测，发现不同时间检测得的微生物略有不同，如在刘自军的论文中以扩增子测序方法，检测到2015年的木材样品细菌以厚壁菌门为主（平均42.3%),真菌以镰刀菌属（F. solani和F.oxysporum)为主，这两种镰刀菌能降解纤维素和木质素，因此需要重点防治；李秋霞的论文中检测得2013年的木材样品以变形菌门为主（52.9%）。

Meng等人[18]用高通量测序法检测柬埔寨柏威夏神庙微生物的DNA和RNA，发现两者差异较大，表明不同细菌的活性有高低差异，或检测的RNA结果更能准确反映主导建筑物生物腐蚀的细菌类型。

免培养的微生物检测方法还有实时PCR法（quantitative PCR)，Ettenauer等人通过[19]实时PCR检测扩增微生物样品β-肌动蛋白DNA，了解室内隔热材料的微生物附着生长情况，从而建议选取珍珠岩灰泥作为最合适的隔热材料，该方法快速、灵敏。

测序技术发展迅速，成本在降低，能分析菌群与环境间、微生物群体间的相互作用，然而目前对这种相互作用的方式和机理认识还不够充分，未来或可积累经验，开发出更成熟的技术方法深入了解各文物的微生物生态系统，从而制订更有针对性的杀灭方法。

（四）生物化学法

生物化学法是研究生物体化学过程的方法，包括酶活性测定、ATP发光测定、生物质谱法、酶联免疫技术（ELISA)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)等。

酶活性测定法可以检测纸质文物上微生物纤维素降解、石质文物上微生物的硫氮代谢、木乃伊或皮质文物微生物胶原降解等的酶活性[20]。ATP发光测定法可使用ATP生物发光检测试剂盒，或ATP荧光检测便携设备，确定霉斑是否有微生物活性，抑菌剂的效力测试，及药剂残留情况[21]，结果有参考价值，操作简便快速。

生物质谱法、酶联免疫法可用于样品中的蛋白质类纺织品检测，如丝绸、动物毛类纺织品，这类纺织制品在墓葬埋藏环境容易降解，无法辨识。李力[22]、 陈华锋[23]用生物质谱法分析墓葬纺织痕迹土样，得到多肽片段序列，比对蛋白库得知其原为丝绸制品。陈华锋的研究还用SDS-PAGE分析老化蚕丝断裂的易发点，了解蚕丝断裂后蛋白分子量的分布情况，建立古代蚕丝老化的评价标准，以做到针对性地选择保护材料和保护方法，提高丝绸的保护水平。刘苗苗[24]、游秋实[25]用ELISA方法对出土泥化丝织品进行检测，能特异地检出样品中含有家蚕丝织品，该方法灵敏度高，且能定量，检出限达到ng/ml。生物化学法可以检测文物的生物病害，也是考古研究的手段，在生物考古中有较大应用。

三、文物的生物破坏防治方法应用

文物外部环境中的病原生物杀灭和去除有物理法、化学法和生物法，生物杀灭主要是利用动植物、微生物等提取的天然成分对真菌、细菌、昆虫等生物破坏进行抑制。这些天然成分需安全有效，包括从海洋无脊椎动物提取的生物活性成分[26]、微生物菌剂、植物提取的萜类、黄酮类、酚类、生物碱、香豆素、单宁、植物精油等[27]。植物精油是混合物，有抗菌防腐功能，可用于化妆品，温和无刺激、环保[28]。天然产物及微生物提取物防虫防霉在食品、生鲜、饲料行业已有相关的研究应用，并且有些成分已开发为防腐保鲜、防霉菌剂产品[29]。

唐欢等人[30]在实验层面证实 5 种植物源提取物（柠檬醛、香茅醇、芳樟醇、香茅醛、香叶油）对博物馆展厅内采集的空气微生物有良好的抑菌效果，可应用为博物馆展厅内的空气微生物净化剂。

郑琳[31]的研究表明肉桂醛、柠檬醛、香茅醛、α-溴代肉桂醛、富马酸二甲酯、对羟基安息香酸酯等作为挥发性防霉剂，低毒或无毒，可用于展柜等密闭空间中，但需要考虑其对文物的质地、色泽的影响。

胡彬彬[32]的专利运用“以原溯源，以物治物”及中药药学原理，结合民间经验，开发出以多种中药材、动植物、矿物为原料提取的有效成分，涂抹于文物表面，能清除污垢、还原色彩、防腐防虫。

王明兹等人[33]的专利用产酶溶杆菌C3菌株发酵液灭菌后制作成防霉菌剂，可用于处理竹木制品，能起到防腐防霉效果。

天然产物是抗菌药物的来源，然而长期使用一种杀虫剂可能会出现抗性、残留、复苏等问题。期待将来可以筛选出持久、无毒无害、广谱、不产生抗药性、绿色环保、易于提取加工的抗虫抗菌剂。

四、文物的生物清洗方法应用

文物的清洗方法有化学法、物理法和生物法，这些方法可以结合使用。生物清洗相对于物理、化学方法，或对操作的要求更高，如活菌、活性成分的提取，活性的维持等，但生物学方法作用条件温和，底物特异，不会影响文物表面颜色，能取得非常好的清洗效果，且对于文物、环境和操作人员来说生物清洗法较为安全。

生物清洗的具体操作主要是利用微生物（细菌、真菌、古生菌）代谢活动、酶、动植物及矿物的天然提取物等来进行清洗。微生物清洗的应用有脱硫弧菌（Desulfovibrio vulgaris)、硫酸盐还原菌（Desulfovibrio desulfuricans)、类产碱假单胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes)去除石质文物黑色硬结物、硝酸盐和硫酸盐，斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri)用来去除盐风化物质、有机物等[34] [35]。酶在清洗领域已广泛应用，且历史悠久，主要有四种类型：蛋白质分解酶、脂肪分解酶、淀粉分解酶和纤维分解酶[36]。植物成分应用于清洗古已有之，如皂角植物水溶液清洗衣服；利用唾液中的酶，以漱口水或者用口嚼萝卜来清洗血污衣、油污衣和汗污衣等[37]。

为了防止过多的水分影响文物的保存，生物清洗操作一般是使用敷料包固定微生物或酶在文物表面进行湿敷。Ferrari等人[38]将淀粉酶刷在结冷胶上，再敷到拜占庭时期的束腰外衣表面，清洗前人修补时留下的老化淀粉胶。这种老化淀粉胶使织物变脆，传统的蒸汽雾化加机械方法无法有效去除，而淀粉酶清洗温度温和、pH接近中性，效果显著，清理后织物恢复弹性，还可以用针线进行修补。Roig等人[39]选取了一株施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri)固定在琼脂中，清洁一座瓦伦西亚教堂13世纪的壁画。该菌能够把壁画上的硝酸盐沉积转化成氮气，可清除九成以上的硝酸盐沉积，且清洁处理一个月后也没有发现细菌残留。

从海洋生物中提取的酶具有低温活性，Palla等人[40]用海洋无脊椎动物蛋白酶清洗画作和蜡雕塑表面的老化蛋白胶层，清除过程可在室温（19-25℃)下进行，比传统蛋白酶温度低。且实验还表明海洋无脊椎动物提取物还具有细菌（肠杆菌属、藤黄球微菌）和真菌（黑曲霉、产青黄霉菌）的抗菌活性。

清洗纺织品文物的案例还有酶复配表面活性剂、天然产物、酶清洗剂去除血渍、脂肪等有机污渍，微生物菌液去除结晶盐等[41]。

五、文物的生物加固方法应用

（一）石质文物的生物加固

微生物在风化石质的加固应用上屡见报导，这种生物方法友好、有效、有潜力[42]。无机化学材料修复石质文物容易导致石质孔隙堵塞，盐结晶膨胀，加剧风化，有机材料与石质无机材料的吸水性有差异，易导致石质受应力破坏。而微生物加固是利用细菌在石质内部，以菌体作为核点，诱导产生碳酸钙晶体，其成分及晶型与基体石质相近，并与之粘结，不堵塞石质的孔隙[43]，细菌产生的碳酸钙硬度比自然界的更大、更能抵抗腐蚀和挤压等外界力量[44]，能用于石灰岩、大理石和汉白玉等石质文物的修复。细菌产碳酸钙是广泛存在的生物钙循环，能产碳酸钙的细菌类型有很多种。

孙延忠等人[45]筛选了一株枯草杆菌-II(Bacillus substilis)在培养基上诱导产生了碳酸钙白色沉淀。Castanier等人[46]在12世纪的圣梅达教堂圣塔上喷涂细菌（Bacillus cereus)及其培养基以加固石塔，经过一年半的观察，发现微生物形成的钙膜质量好，稳定性高，能对原基质起到保护作用，此技术已用于巴黎私人建筑大面积大规模处理；Perito等人[47]为了防止修复用的微生物及培养基引起不良微生物的生长，用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)的细胞碎片产碳酸钙，修复 6 世纪的石质纪念碑，效果理想。

（二）纺织品文物的生物加固

纺织品的保护加固方法有物理加固法、装裱法、针线修复法，化学的胶粘剂加固法、丝蛋白加固法、生物加固法[48]。

林珍[49]利用微生物谷氨酰胺转氨酶催化人工老化脆弱羊毛织物与同源角蛋白交联键接加固，观察到羊毛织物的纤维上断裂分子链的氨基酸残基与所添加的氨基酸能发生键接，同时羊毛织物纤维断裂分子链间或链内也可能会发生重新交联键接，取得良好的加固效果，并且加固处理不会对羊毛织物的外观带来不良影响。

吴顺清等人[50]用细菌纤维素喷涂在人工老化丝织品上，发现细菌纤维素能连结丝纤维，起到加固作用，增强样品拉力，且细菌纤维素在紫外及臭氧处理后能被可逆去除，可用于糟朽丝织品加固。

细菌纤维素是细菌的胞外产物[51]，可由多种细菌产生，与植物纤维素结构有差异，其形态可随培养条件控制，纯度高，产量大，聚合度可调控，或可替代植物纤维素，以达到减少树木砍伐的可持续绿色发展目标。细菌纤维素可用于纺织类、纸质、木质文物的修复加固，且已应用在食品工业、造纸、医学等领域[52] [53]。

吴顺清等人的文保创新项目[54]利用微生物菌群转换纤维，合成与天然丝蛋白结构和性能相似的物质，用于出土丝织物的加固，加固后丝绸强度增加，可任意折叠，且能避免加固材料老化，化学残留等问题。

（三）木质文物的生物加固

木质文物若储存不当，尤其是长期埋藏在水环境中的饱水木质文物，其中起支撑结构作用的纤维素容易被降解而强度降低、糟朽。饱水木质文物目前主流的加固方法是化学加固法，主要加固材料是PEG、糖类、乙二醛等。

刘麓琪[55]发现先用木糖醇与海藻糖浸泡，再用产纤维素红茶菌液共培养方法加固人工降解木片，细菌纤维素填补了木片表面的裂隙，木片强度加强，加固效果良好。

陈中行等人[56]的课题用微生物法处理木构件的脱水定型，利用木醋杆菌或其他微生物将葡萄糖转化为纤维素，从而修复补充木构件中已经降解损伤的纤维素，达到加固定型效果。

周松峦等人[57]将饱水木块与醋杆菌（Acetobacter sp.)共培养，细菌纤维素能与植物纤维素结合，修复损伤的纤维素，木质内部间隙明显变小。

生物加固的优点是可以选用与文物同源的加固材料，或者引入微生物在文物内部产生这种材料，这些加固材料能与文物自身材料交联，相容性好，使文物强度加大，且不会引入新的污染。然而微生物诱导产生的加固材料结构会随着培养条件的改变而有不同，其加固修复作用的代谢反应机理需要进一步研究，以更好地控制加固修复反应。

六、总结

文物的生物病害检测可运用生物学方法，还可以“对症下药”，用于防治微生物腐蚀、虫害等，还可以利用微生物酶或代谢产物对文物表面附着物进行生物清洗，还可以运用微生物菌体或其代谢物以对脆弱文物进行加固。

本文所列的检测方法、材料应用是基于国内外文献的总结概述，但由于本人能力不足，还有许多方面需要补充，应用于文物保护的生物学方法还有很多，且不断有新方法应用，新活性分子开发，且文物保护领域研究手段丰富，有越来越多的学科交叉协作，研究成果显著。生物材料不易筛选，操作复杂，或需要精确的培养条件，有局限性，目前文保的主流仍是更加成熟和经验积累较多的物理、化学方法，而且不同加固方法和材料有不同的优缺点和效果，随着时间的推移会面临更多新的问题和挑战，需要更多人力、资金、实验和摸索。生物学的文保方法目前大多还在实验阶段，希望将来生物学的文物保护方法会有更好的表现，实现商品化、产业化。