60Co-γ射线对睡莲生物学效应的影响

史明伟 潘 鸿 颜佳宁 金奇江 王彦杰 徐迎春,*

(1 南京农业大学园艺学院/农业农村部景观设计重点实验室，江苏 南京 210095；2 南京水一方文化旅游发展有限公司，江苏 南京 210058)

睡莲是睡莲科(Nymphaeaceae)睡莲属(Nymphaea)植物的通称，该属有50多个种(含变种)，依形态特征可分为5个亚属，分别为耐寒睡莲亚属、广热带睡莲亚属、古热带睡莲亚属、新热带睡莲亚属和澳洲睡莲亚属[1]。睡莲是重要的水生花卉和世界名花，花色丰富，花期长，易栽培，在城乡的公共绿地水体绿化、美化与净化中发挥着重要作用[2]。睡莲的栽培、育种和应用在全球范围内受到广泛关注[3]，育种目标主要以独特的花色为主。目前睡莲新品种大多数都是通过人工杂交和自然杂交培育，结果随机性较强。因此，对睡莲开展新的育种手段研究十分重要。

辐射诱变具有突变频率高、突变谱广、育种年限短等优点，能诱发产生自然界罕见或应用一般常用方法难以获得的新性状[4]，并且能改善种子的萌发[5]，促进植物的生长和开花[6]。辐射育种已被广泛运用于观赏植物新品种的选育，如林兵等[7]研究表明60Co-γ辐射处理能诱导出白色和紫色的荷兰鸢尾；台德强等[8]以不同剂量的60Co-γ射线对3种变色叶类观赏海棠进行辐射处理，不仅能改变叶片与花瓣的形态，还能改变其色泽。此外，傅巧娟等[9]、李树举等[10]和陈秀兰等[11]均通过60Co-γ射线选育出不同植物的新品种。

目前，国内外鲜见关于睡莲辐射诱变的研究，张启明等[12]对睡莲N. Colorado植株进行了不同剂量的电子束辐射处理，发现电子束辐射可引起睡莲花量减少、花色改变，并诱发DNA产生变异。而60Co-γ射线在睡莲育种中的应用鲜见报道，因此开展60Co-γ射线辐射睡莲的研究，对培育睡莲新品种具有重要的意义。为此，本试验选取耐寒睡莲弗吉尼亚(N. Virginia)和奥毛斯特(N. Almost black)为试验材料，用不同剂量的60Co-γ射线进行辐射处理，研究其生物学效应，以期为进一步选育睡莲新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种为2个耐寒睡莲品种，分别为花色为白色的弗吉尼亚和暗红色的奥毛斯特，由南京艺莲苑花卉有限公司提供。

1.2 试验方法

于2018年4月，在上海束能辐射技术有限公司对睡莲块茎进行60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量率为1 Gy·min-1。 分别设置0(CK)、5、10、15、20、30、40、50 Gy 8个处理，每处理各辐射20株。辐射处理后，将睡莲块茎种植于口径为380 mm的盆内，并套上口径为535 mm 的大盆，置于室外进行常规培养，日平均气温约为20℃。

1.3 睡莲生物学指标测定

睡莲块茎移栽1个月后统计存活数，并以辐射剂量为横坐标，存活率为纵坐标作拟合直线回归方程Y=a+bX，计算半致死剂量(LD50)，并于盛花期观测睡莲浮叶数、花径、叶面积、开花时间以及变异情况。

存活率=(成活数/种植数)×100%

(1)

开花率=(开花株数/存活数)×100%

(2)

叶片变异率=(叶片变异株数/存活数)×100%

(3)

花部变异率=(花部变异株数/存活数)×100%

(4)

花期延迟天数(d)=试验组第一朵花开时间-对照组第一朵花开时间

(5)

花期(d)=最后一朵花谢的时间-第一朵花开的时间

(6)。

1.4 数据分析

利用Microsoft Office Excel 2017和SPSS 21. 0 对试验数据进行统计和方差分析。

2 结果与分析

2.1 60 Co-γ射线辐射对睡莲存活率的影响

由表1可知，不同剂量60Co-γ辐射处理对2个睡莲品种的存活率均产生了影响，且存活率均随着辐射剂量的增加而降低。对照组弗吉尼亚、奥毛斯特的存活率分别为100%、95%；辐射剂量为5～20 Gy时2个睡莲品种的存活率略有下降；辐射剂量为30 Gy时，弗吉尼亚、奥毛斯特的存活率分别急剧下降至30%和45%；继续增大辐射剂量，2个睡莲品种的存活率持续下降，当辐射剂量为50 Gy时，2个睡莲品种均无法存活(存活率为0)。分别对2个睡莲品种的存活率和辐射剂量进行线性回归分析，得出弗吉尼亚的半致死剂量为24.342 Gy，奥毛斯特的半致死剂量为27.671 Gy。

表1 60 Co-γ射线辐射对睡莲存活率的影响Table 1 Effect of 60Co-γ irradiation treatment on the survival rate of water lily /%

2.2 60 Co-γ射线辐射对睡莲开花时间的影响

由表2可知，经60Co-γ射线辐射处理后，2个睡莲品种的初始开花时间均随着辐射剂量的增加而延后。其中，与CK相比，5～15 Gy辐射处理下弗吉尼亚的开花时间显著延后，但各处理组间无显著差异；辐射剂量为20 Gy时，弗吉尼亚的开花时间显著推迟19 d，而辐射剂量为30、40 Gy时开花时间延后程度更大，分别显著延长至59 和61 d；辐射剂量为50 Gy时，弗吉尼亚未能开花。经60Co-γ射线辐射处理后，奥毛斯特的初始花期变化趋势与弗吉尼亚一致，但辐射剂量为40 Gy时，奥毛斯特就未能开花。总花期方面，在低剂量(5～20 Gy)辐射处理下，2个睡莲品种所受影响不明显，但在高剂量(30～40 Gy)辐射处理下，睡莲花期受到显著影响，花期极短，仅有3～4 d。由此可见，辐射处理推迟了2个睡莲品种的开花时间，且辐射剂量越高，开花越晚；而对整个花期时间并无明显影响。

2.3 60 Co-γ射线辐射对睡莲浮叶数和叶面积的影响

由图1-A可知，辐射处理对2个睡莲品种的叶面积均有影响，低剂量辐射处理(5～10 Gy)时，睡莲叶面积均显著大于CK，且在辐射剂量为5 Gy时叶面积达到最大，说明低剂量辐射处理能够促进睡莲叶片的生长；高剂量辐射处理(20～40 Gy)时，2个睡莲品种的叶面积均随着辐射剂量的增加而显著降低，说明高剂量辐射处理能有效抑制睡莲叶片的生长。

表2 60 Co-γ射线辐射对睡莲开花时间的影响Table 2 Effect of 60Co-γ irradiation on flowering time of water lily /d

由图1-B可知，随着辐射剂量的增加，2个睡莲品种的浮叶数与叶面积呈相同趋势，在低剂量(5～10 Gy)辐射处理时浮叶数较CK增加，但无显著差异；高剂量(20～40 Gy)辐射处理时，随着辐射剂量增加睡莲浮叶数逐渐减少，其中，当辐射剂量为30～40 Gy时，睡莲浮叶数显著少于其他处理组。

注：不同小写字母表示同一品种不同辐射剂量处理间差异显著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant differences between difference irradiation treatment at the same cultivar (P< 0.05). The same as following.图1 60 Co-γ射线辐射对睡莲叶面积(A)、浮叶数(B)的影响Fig.1 Effects of 60 Co-γ irradiation treatment on leaf area(A)and floating leaf number(B)of water lily

2.4 60 Co-γ射线辐射对睡莲开花率和花径的影响

由图2-A可知，2个睡莲品种的开花率呈现相同的变化趋势，均随着辐射剂量的增加而降低。CK中2个睡莲品种的开花率均达到了100%；辐射剂量为5～15 Gy时，睡莲开花率与CK相比差异不显著；辐射剂量为20～40 Gy时，睡莲开花率显著低于CK，表明高剂量辐射处理对2个睡莲品种的开花率有显著抑制作用。

由图2-B可知，未经辐射处理(CK)时，弗吉尼亚和奥毛斯特的花径分别为11.23、12.97 cm，经辐射处理后，随着辐射剂量的增加，睡莲花径呈现逐渐减小的趋势。当辐射剂量为5 Gy时，2个睡莲品种的花径均增大，但与CK相比无显著差异；当辐射剂量为10～20 Gy时，睡莲花径均显著减小，但处理组间无显著差异；当辐射剂量为30～40 Gy时，睡莲花径进一步减小。由此可见，较高剂量60Co-γ辐射处理显著抑制了睡莲花径的生长。

2.5 60 Co-γ射线辐射后睡莲叶片的变异情况

由表3可知，辐射处理后2个睡莲品种的叶片变异率均很高，且变异率随着辐射剂量的增加而升高。经辐射处理后，2个睡莲品种的叶片均发生了较多类型的变异，且变异性状相似。由图3可知，2个睡莲品种的叶片均出现了红棕色斑块，且随着辐射剂量的增加，红棕色面积逐渐扩大。此外，还发生了较多类型的畸变(图4)，变异叶片出现的类型有：叶片叶缘不规则(图4-A1、B4、B5)，叶片半边叶缘出现锯齿(图4-A6、B7)，叶片两边叶缘出现锯齿(图4-A7)；叶片有两处缺刻(图4-A3、A5、B6)，叶片有孔(图4-A10)，叶片皱缩(图4-A9、B8)，叶片卷曲(图4-A12、B9、B12)，叶片重叠(图4-A3、B6)；叶片有黄色斑块(图4-A2、B2、B3)、叶片有粉色斑块(图4-B11)，且辐射剂量越高，睡莲叶片出现的变异类型越多。

表3 60Co-γ射线辐射后睡莲叶片的变异率Table 3 Variation rate of water lily leaf after 60Co-γ irradiation treatment /%

2.6 60 Co-γ射线辐射后睡莲花朵的变异情况

由表4可知，奥毛斯特花部性状的变化率远高于弗吉尼亚，在辐射剂量为5 Gy时，接近一半的植株的花出现变异，且随辐射剂量的增加，变异率逐渐升高，辐射剂量至30 Gy时，所有处理植株的花均发生变异。而弗吉尼亚仅在30 Gy处理时开始出现较高的变异率。

由图5可知，辐射处理对白色花的弗吉尼亚花部的影响不大，变异率较低，仅发生2例变异(图5-B、C)，表现为变异花瓣不能完全展开、花径小、花瓣少、萼片少且部分变短等特征。而辐射处理对奥毛斯特花部有显著影响，变异率较高，尤其在花色上。正常奥毛斯特的花(图5-D)为暗红色，内部花瓣近墨黑色，经过辐射处理的花朵发生了不同程度的褪色现象，花色出现了粉色(图5-F)、淡粉色(图5-G)和白色(图5-H)。奥毛斯特还出现了一朵橙色花(图5-Ⅰ)以及花瓣一半变白的变异性状(图5-L)。此外还发现了花型变异的花朵(图5-K)，花朵部分萼片变短，与弗吉尼亚(图5-B、C)类似，变异花有3个长萼片，构成三角花型。

注：A：弗吉尼亚；B：奥毛斯特。Note: A: N. Virginia. B: N. Almost black.图3 60 Co-γ 射线辐射处理后2个睡莲品种叶片红棕色变异情况Fig.3 Variation of red-brown leaves of two cultivars of water lily treated by 60Co-γ irradiation

注：A：弗吉尼亚；B：奥毛斯特。Note: A: N. Viriginia. B: N. Almost black.图4 60Co-γ 射线辐射后2个睡莲品种叶片形态的变异情况Fig.4 Variation of leaves morphology of water lily treated by 60 Co-γ irradiation

表4 60 Co-γ辐射后睡莲花部的变异率Table 4 Variation rate of water lily flowers after 60Co-γ irradiation treatment /%

注：A～C为弗吉尼亚，其中A为未进行辐射处理的对照株，B和C为辐射处理的变异株；D～L为奥毛斯特，其中D为对照株，E～L为辐射处理的变异株。Note: A to C are N. Virginia, A is control plant no-treated by irradiation, B and C are variation plant treated by irradiation; D to L are N. Almost black, D is control, E to L are variation plant treated by irradiation.图5 60Co-γ射线辐射后2个睡莲品种花部性状的变异情况Fig.5 Effects of 60Co-γ irradiation treatments on the flower characters of water lily

3 讨论

本研究中，60Co-γ射线辐射处理显著影响睡莲的成活率，且睡莲的成活率随着辐射剂量的增加而下降，这与荷花[13]、德国鸢尾[14]和苹果[15]等的研究结果一致。LD50常作为适宜的诱变剂量指导辐射育种，不同植物的LD50存在差异。余蓉培等[16]采用60Co-γ射线对波士顿蕨绿色球状体进行辐射处理，得到LD50为128 Gy；周亚倩等[17]得到树兰蒴果60Co-γ射线的LD50为78.08 Gy；何岭等[18]以不同剂量60Co-γ 射线辐射处理海州常山一年生根蘖苗，得出海州常山根蘖苗的LD50为41.07 Gy。而本研究中，弗吉尼亚的LD50为24.342 Gy，奥毛斯特的LD50为27.671 Gy，较前人的结果偏低，这可能与睡莲块茎上的休眠芽对60Co-γ射线比较敏感有关。

通常认为60Co-γ射线辐射对植物生长发育的影响表现为低剂量促进高剂量抑制[19]，Kim等[20]研究发现低剂量(1～2 Gy)60Co-γ射线辐射处理轻微促进拟南芥幼苗苗高的生长，而高剂量(大于50 Gy)辐射处理则显著抑制幼苗生长。在本研究中，低剂量(5～10 Gy)辐射处理促进睡莲叶片的生长，使睡莲叶面积和浮叶数显著增加；高剂量(20～40 Gy)辐射处理有效抑制了睡莲叶片的生长，显著减少了睡莲叶面积和浮叶数，这与前人的研究结果一致。

本研究中，60Co-γ射线辐射处理对睡莲的开花时间也有显著影响，2个睡莲品种的开花时间均随着辐射剂量的增加而延迟，在低剂量(5～15 Gy)辐射处理时，睡莲初花期与CK相比延迟了3～9 d，高剂量(20～40 Gy)辐射处理则严重延迟了开花时间，但整个花期时间长度无显著变化，这与陈秀兰等[11]和任少雄等[21]的研究结果吻合。此外，刘春贵等[22]采用60Co-γ射线辐射处理鸢尾，发现200 Gy辐射剂量对多数鸢尾品种的花径有抑制作用；赵兴华等[23]以60Co-γ射线辐射处理3种切花百合鳞茎，发现辐射处理显著降低了百合植株的开花率。而本研究中，辐射剂量为10～40 Gy时，睡莲花径显著减小；辐射剂量为10～40 Gy时，睡莲的开花率随辐射剂量的增加而降低，这与前人的研究结果一致。

在其他植物辐射变异性状的研究中，辐射处理的植物叶片会出现花叶、条纹叶以及畸形叶等性状[24]。本研究中，经60Co-γ射线辐射处理后的睡莲叶片出现锯齿、皱缩、小孔、卷曲、黄化等变异性状，这与前人的研究有一定的相似。诸多研究表明，在一定范围内，随着辐射剂量的增加，辐射损伤越明显，后代出现的变异也随之增加[25-26]。本研究中，随着辐射剂量的增加，睡莲叶片出现红棕色斑块的面积增大，同时，叶片出现的变异类型增多，表明高剂量辐射处理可以用来培育具有特殊叶色的睡莲新品种。

60Co-γ射线辐射处理后，植物花瓣会出现畸形和褪色、金黄色线条相嵌、白色斑点状花纹等变异性状[7]。包建忠等[27]研究发现辐射对观赏荷花的花色有一定的影响，红色系和复色系品种易产生诱变，大多由原来的粉红色转变为淡粉色或红白瓣，白色系品种未发现变异性状；郭安熙等[28]通过辐射处理不同菊花品种表明，绿花、白花、黄花品种诱发花色变异的频率极低，而粉紫色品种较易诱发花色变异。在本研究中，白色的弗吉尼亚花色未发生变异，暗红色的奥毛斯特花色发生了变异，花色由暗红色褪色为粉色、淡粉色和白色，这与前人的研究结果一致，因此，辐射诱变睡莲时，推荐选用花色艳丽的品种为辐射材料。此外，本研究还发现，辐射处理能造成睡莲花型发生变异，2个睡莲品种均发现了花型变异的现象，这在观赏植物辐射诱变研究中还未见报道。在单盆睡莲中，只有先开的几朵花的花色发生了变异，之后开的花并未发生变异，这可能是由于辐射室内空间剂量分布不均匀，也有可能是睡莲块茎体积大，辐射时未接受到均匀的剂量。研究表明，60Co-γ射线造成的变异性状，在下一代栽培中，有时不能稳定保持[7,29]，而本研究只探讨了辐射对VM1代的表型变异，变异性状能否在VM2及以后世代中稳定表达，还需进一步的观察与鉴定。

4 结论

本研究结果表明，60Co-γ射线辐射处理睡莲块茎的适宜剂量为20～30 Gy；白色睡莲品种可以用来培育叶色新品种，红色睡莲品种既可以用来培育叶色新品种，也能用来培育花色新品种；60Co-γ射线不仅可用于选育微型、小花睡莲品种，而且可用于调控睡莲的花期。本研究结果为辐射诱变选育不同用途的睡莲新品种奠定了基础。