血液的冷冻保存

文丨李兴华（攀枝花市中心血站）

导读冷冻保存是血液保存的主要方式之一，目前，血液冷冻保存工艺已经比较成熟，冷冻血已经开始被应用与临场治疗当中。血液冷冻保存方法在解决血液长期储存、稀有血液储存以及保障供血等方面具有重要意义。事实上，早在上世纪40年代就已经开始了关于冷冻血液的相关研究，PIige、Smith发现甘油可以对牛精子冷冻保存形成一定的保护，由此得到启示，在次年就利用甘油制作出冷冻保护剂，实现了红细胞的冷冻保存。此后，TuIIis经过研究解决了如何去除冷冻保护液的问题，使得冷冻保存的红细胞初步应用与临床当中，但是由于操作比较复杂，未能实现大范围推广。Huggins于1963年改进了去除冷冻保护剂的方法，自此之后，冷冻保存红细胞开始大范围在临床当中应用。后续随着各项工艺的不断完善，成功地开创出了一项保存血液的新途径。

血液冷冻保存法的优点

其一，采用冷冻保存法可以使血液的保存期限延长至10年，这对于缓解血液供不应求的问题有极大的作用，尤其是对需要输入稀有血液的患者来说是一大福音。采用冷冻法保存血液，需要使用时只需要进行解冻洗涤即可，极为便捷，并且保存期限长，可以使一些稀有血液得到妥善保存。

其二，经过洗涤操作的血液，其中大部分白细胞、血浆蛋白以及血小板被去除，可以有效减轻输血造成的不良反应，尤其是对于患有血液病、肾功能异常、心功能不全等患者极为适用，对于存在过敏性输血反应的患者也是比较理想的选择。

其三，冷冻保存的血液2、3-DPG含量和冷冻之前没有明显的变化，基本接近与正常血液的含量，输血后其氧释放能力要优于保存血，可以快速纠正患者缺氧的情况，在胸外科手术以及新生儿换血手术中具有较高的应用价值。

其四，冷冻保存的血液由于去除了其中的细胞代谢产物、可能存在的肝炎病毒以及抗凝剂，因此，即使大量输血也可以有效避免出现酸中毒、肝炎以及钾血症的情况，并且由于去除了血液中的抗体A和B，使得O型血成为了真正意义上的万能血。

冷冻保存血液的工艺虽然相对比较繁琐，需要一定的设备辅助，但是其在实际当中所取得的效果极为明显，在抢救需要输血的患者方面发挥了重要作用，挽救了很多生命，并且也使得很多稀有血液可以长期有效保存。

制备冷冻红细胞的方法

目前，制备冷冻红细胞比较普遍的方法有两种，分别是快速冷冻法以及慢速冷冻法。快速冷冻主要是利用低浓度的甘油对红细胞进行处理，使得红细胞当中的甘油浓度保持在18%（W/V）左右，然后需要将处理后的红细胞放置在液氮（温度为-196℃）当中迅速冷冻，最后将冷冻后的红细胞放置液氮蒸汽（温度为-156℃）当中储存。其需要使用到制氮设备以及大容量的液氮罐，这种方法目前尚未在国内全面普及。慢速冷冻法主要是利用高浓度的甘油对红细胞进行处理，使红细胞当中的甘油浓度保持在40（W/V）左右，对于冷冻的速率没有严格的要求，采用机械冰箱冷冻即可。其操作相对比较简单，也不需要使用复杂的设备，主要采用的设备是大容量的冰箱，温度需要保持在-65℃以下，这种方法易于操作，且成本相对较低，因此普及范围较广。慢速冷冻法按照去除冷冻保护剂的方法又可以分为两种，其一是盐业离心洗涤，其二是糖业聚集洗涤，二者洗脱甘油的方法虽然存在差异，但是其基本原理一致，首先以高涨溶液促使已融化的高渗红细胞渗透压保持平衡状态；其次采用逐渐下降的高涨溶液开始分次洗涤；最后以含有葡萄糖的等渗NaCI悬浮。

慢速冷冻法洗涤制备的方法

其一，糖业聚集洗涤法首先，将冷冻保存的血液放置在温度为37～40℃的水浴中慢慢融化；其次，采用500ml10%蔗糖溶液进行洗脱，持续3次，去除上清血红蛋白；再次，加入0.9%NaCI100ml进行悬浮，离心去除上清血红蛋白，在重新加入0.9%NaCI100ml悬浮；最后检测上清血红蛋白符合输血标准后应用于临床。

其二，盐业离心洗涤法。首先，将冷冻保存的血液放置在温度为37～40℃的水浴中慢慢融化；其次去除甘油红细胞，加入9%NaCI40ml，再加入0.9%NaCI250ml，离心去除上清血红蛋白，再加入500mL0.9%NaCI再次离心去除上清血红蛋白，并用0.9%NaCI洗涤；再次悬浮红细胞，采用0.9%NaCI100ml进行悬浮；最后检测上清血红蛋白符合输血标准后应用于临床。

冷冻红细胞质量标准

一般来说，采用的洗涤方法不一样，红细胞的质量标准也会存在一定的差异，并且随着冷冻保存的工艺越来越完善，质量标准也在不断变化，目前，普遍使用的质量标准包括以下几方面。其一是红细胞的回收率要超过80%以上；其二是冷冻保存的血液解冻后输入人体，在24h以内，红细胞的存活率不低于70%；其三是执行洗涤操作后，悬浮液当中上清血红蛋白的含量在1g/L以下；其四是悬浮红细胞甘油含量不超过1%；其五是悬浮红细胞体外溶血实验，上清血红蛋白的增加量在50%以下；其六是ATR和2、3-DPG以及红细胞脆性接近与正常状态下的血液。