鸭疫里默氏杆菌和鹅细小病毒混合感染的实验室诊断

袁 标 ，张 海 ，邓珊珊 ，蔺俐仲 ，袁 林 ，罗登荞 ，景书灏 ，徐春志 ，刘 霞 ，杨 源 ，刘 艳

（1.贵阳市息烽县农业农村局，贵州 贵阳 551100；2.贵阳市动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳550081；3.贵阳市清镇市农业农村局，贵州 贵阳 551400；4.贵阳市草地站，贵州 贵阳 550081；5.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550001）

近年来贵州大力发展养殖业，其中生态家禽为农村产业革命重点发展的特色产业之一。生态家禽养殖规模快速发展，但是由于部分养殖场养殖技术跟不上、养殖密度增大等原因，鸭场经常发生各类疾病，如病毒性疾病、细菌性疾病和寄生虫病等，其中鸭疫里默氏杆菌病和鹅细小病毒病，已成为危害养鸭业发展的重要疾病之一。鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌引起的一种急性、败血性、接触性传染病[1]。鸭疫里默氏杆菌属于里默氏杆菌属黄杆菌科，革兰氏染色呈阴性，短杆状，美兰染色为两极浓染，不产生芽孢[2]。鸭疫里默氏杆菌主要易感动物为鸡、鸭、火鸡等，对2～3周龄雏鸭最易感染。发病家禽的主要病理变化为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎。我国自20世纪80年代首次报道该病以来，目前已在江苏、湖南、湖北等地相继发生。鹅细小病毒病是由鹅细小病毒引起的一种急性传染病。鹅细小病毒是细小病毒科单股线状无囊膜DNA病毒，可引起鸭发生下痢、跛行、后肢瘫痪等临床症状[3]。该病自1971年在法国首次报道，2014年后在我国广西、江苏、广东、福建等水禽养殖集中区域呈现流行态势[4]。贵州省某鸭场购进 7日龄雏鸭10000只，饲养至9日龄后鸭群逐渐出现被毛散乱、精神沉郁、行动迟缓、站立不稳和跛行等临床症状，并有大量雏鸭死亡，雏鸭15日龄时已死亡4000余只。剖检病死鸭可见其肝脏肿大呈灰白色、心包膜纤维素性渗出，部分患病鸭脾脏肿大呈大理石样，肠系膜出血，肠腔肿胀。鸭群6日龄时使用益康泰、恩诺沙星。7日龄接种禽流感H9+新城疫二联灭活疫苗，8日龄投喂氟苯尼考、双黄连口服液、黄金维他，11日龄接种禽流感H5N1-8+H7二价灭活疫苗。18日龄注射益康泰、青霉素、链霉素，取得了明显效果。为了进一步确诊该养鸭场雏鸭异常死亡的病因，采用了流行病学调查、病理剖检、细菌分离鉴定、细菌PCR检测、药敏试验和病毒核酸检测等实验室诊断方法，以期为后期防控提供参考。

1 材料和方法

1.1 病料

选择患病雏鸭5只，剖检并无菌采集其心包液、肝脏组织、脑组织样本。

1.2 主要试剂和培养基

2×TaqPCR MasterMix、DNA Marker DL2000、细菌基因组提取试剂盒均购自天根生化科技有限公司；DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒、禽流感病毒通用型核酸检测试剂盒、新城疫病毒核酸检测试剂盒、鸭圆环病毒核酸检测试剂盒、鹅细小病毒核酸检测试剂盒、鸭坦布苏病毒核酸检测试剂盒、鸭肝炎病毒核酸检测试剂盒均购自北京世纪元享公司；新生牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司；试验所用的抗菌药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；巧克力培养基为实验室自制。

1.3 细菌分离培养

在二级生物安全柜中无菌接种5只受检鸭的心包液、肝脏组织于巧克力琼脂平板，分别置于37℃培养箱中进行有氧和厌氧恒温培养18 h。

1.4 病毒核酸检测

在二级生物安全柜中，取病鸭内脏及脑组织样本，加入适量PBS缓冲液，研磨匀浆后，离心取上清，采用RNA/DNA提取试剂盒分别提取病毒RNA/DNA，进行禽流感病毒、新城疫病毒、鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒和鸭肝炎病毒核酸检测。

2 结果

2.1 细菌分离培养及形态

经37℃无氧过夜培养的巧克力琼脂平板，菌落表面光滑湿润、边缘整齐、半透明呈露滴状。挑取单个菌落进行纯化培养，经革兰氏染色，镜检显示分离菌为革兰氏阴性短小杆菌。初步判断为鸭疫里默氏杆菌。

2.2 细菌PCR鉴定

根据鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A(OmpA)基因设计特异性引物，预扩增片段为663 bp。挑取纯化培养的单个菌落到含5%新生牛血清的液体培养物中，震荡过夜培养。参照细菌基因组提取试剂盒说明书提取细菌总DNA，加样进行PCR扩增，采用25 μL反应体系进行PCR扩增，扩增程序为95℃预变性3 min，然后进入95℃变性45 s、54.1℃退火45 s和72℃延伸45 s的35次循环，最后72℃再延伸10 min。取PCR扩增产物8 μL，1.2%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，鸭疫里默氏杆菌阳性对照和分离菌样本在663 bp处均出现特异性条带，说明本次厌氧培养后分离得到的细菌为鸭疫里默氏杆菌。

2.3 细菌药敏试验

药敏试验采用药敏纸片琼脂扩散法，参照美国临床实验室标准化协会 （Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）制定的标准进行，药敏结果判断标准按NCCLS2010年标准进行。对分离得到的鸭疫里默氏杆菌分离株进行药敏试验，结果发现分离菌对头孢呋辛、头孢唑啉、氨苄西林、羧苄西林、万古霉素、庆大霉素、新霉素和丁胺卡那等抗菌药物均呈不同程度的耐药性，而对头孢氨苄、头孢哌酮、头孢拉定、哌拉西林、氧氟沙星、诺氟沙星和米诺环素等抗菌药物呈现良好的敏感性。

2.4 病毒核酸检测结果

对5份病料组织进行禽流感病毒、新城疫病毒、鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒、鸭肝炎病毒核酸检测，其中禽流感病毒、新城疫病毒、鸭圆环病毒、鸭坦布苏病毒、鸭肝炎病毒核酸检测结果为阴性，5份样本均扩增出与鹅细小病毒预期相符的目的片段，结果见图2。提示鸭群存在鸭圆环病毒感染。

3 结论

经流行病学调查、病理剖检、细菌分离鉴定、细菌PCR检测、药敏试验和病毒核酸检测等实验室方法进行诊断，确诊引起该养鸭场雏鸭异常死亡的病因为鸭疫里默氏杆菌和鹅细小病毒混合感染。药敏试验发现，分离菌对头孢氨苄、头孢哌酮、头孢拉定、哌拉西林、氧氟沙星、诺氟沙星和米诺环素等抗菌药物呈现良好的敏感性。

4 讨论

鸭疫里默氏杆菌血清型众多，据报道已经鉴定的血清型有21种，国内主要流行的血清型是1型、2型和10型[5]，不同血清型之间的交叉保护效果较低，因此使用疫苗免疫后，常常也会有该病的流行。由于缺乏有效的疫苗进行预防，临床上治疗鸭疫里默氏杆菌病主要以抗生素为主，但是近年来随着养殖量的增加和抗生素的滥用，有的养殖场出现了多重耐药的情况，所以合理使用敏感抗生素，对治疗和预防鸭疫里默氏杆菌病显得十分重要。

临床上鹅细小病毒病没有特效的治疗药物和疫苗，因此早期的临床诊断非常重要。临床上可以根据临床症状和剖检病变，进行初步判断，通过实验室诊断进行病原确诊。鹅细小病毒的实验室诊断方法主要有病毒分离鉴定、免疫组化试验、琼脂扩散试验、PCR检测、荧光定量PCR检测等。由于病毒分离鉴定、免疫组化试验和琼脂扩散试验耗时较长，并且操作繁琐。PCR检测和荧光定量PCR检测耗时相对较短，是实验室诊断常用的检测方法。

由于鸭疫里默氏杆菌病和鹅细小病毒病没有特效的疫苗和治疗药物，因此只有通过加强生物安全防控措施来防止鸭群出现感染。首先必须做好引种检疫和合群前隔离工作，不在有鸭疫里默氏杆菌病和鹅细小病毒病流行的区域和养殖场引种，做好禽流感、新城疫等相关疫病的基础免疫工作和免疫抗体监测。加强养殖场生物安全体系建设和饲养管理水平，加强环境卫生消毒和雏鸭保暖工作，合理使用抗生素和消毒药物。