槲皮素对大鼠废用性骨质疏松的预防作用及ERK1/2-MAPK信号通路的影响

王 鹏，夏晓枫，左 斌，何精选，罗 斌，邹 凯

缺乏机械负荷或机体运动障碍可能会造成骨骼结构和完整性的变化，导致严重的骨质流失废用性骨质疏松症[1-2]。宇航员在太空飞行期间1个月骨质丢失达到总骨量的2%，相当于绝经1年以上女性的骨质流失。既往文献报道，由于下肢轴承重量的消除，多达10%的骨量可能会丢失[3-4]。废用性骨质疏松症相关的主要病理变化是骨孔增加和强度降低，导致骨折，引起机体功能恶化和病死率增加。越来越多的证据表明，骨形成的减少是废用性骨质疏松症发展的主要指标之一[5]。槲皮素是从芦丁(芸香甙)、槲皮甙、金丝桃甙中提取的主要生物活性黄酮类化合物，具有免受绝经后、糖皮质激素、维A酸、睾丸切除术和衰老引起骨质疏松症的有益作用[6]。槲皮素体外实验已被证明可有效增强成骨细胞的增殖和分化，增加成骨标志物如骨钙素(OC)、骨桥蛋白(OPN)、骨保护素(OPG)和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的表达[7]。同时，槲皮素可以通过阻止核因子-κB(NF-κB)受体活化因子配体(RANKL)诱导的NF-κB和细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号级联激活以及破骨细胞基因标记的表达来消除破骨细胞生成和破骨细胞分化[8]。细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在成骨调节中起重要作用[9]。本研究探讨了槲皮素对大鼠废用性骨质疏松的预防作用及对ERK1/2-MAPK信号通路的影响，旨在为废用性骨质疏松症的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 槲皮素(原料药，纯度95%，西安绿天生物技术有限公司，批号Q19057)；强骨胶囊(北京岐黄医药股份有限公司，规格0.25 g/粒，批号190817)；安息香酊、水合氯醛、化学发光试剂盒(碧云天生物技术研究所，批号C0946、C17496、P0018S)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司，批号LK-00697)；ReverTra Ace qPCR R反转录试剂盒、SYBR®GreenRealtime PCR Master Mix试剂盒(上海达姆实业有限公司，批号FSQ-101、QPK201)；放射免疫沉淀缓冲液(上海远慕生物科技有限公司，批号YM-S2014)；Nuclear Extract Kit试剂盒(上海艾跃生物科技有限公司，批号40010)；BCA蛋白定量试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，批号PA1197)；聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)膜(赛默飞世尔科技中国有限公司，批号SY55491)；ERK1/2、MAPK、β-actin一抗、辣根过氧化物酶缀合的二抗(安诺伦北京生物科技有限公司，批号P0655、P0742、PQ10339、SF-13556)；DXA-09型双能X线发射仪、ImageQuant LAS 4000型化学发光成像分析仪(美国GE Healthcare公司)；西门子显微CT机(德国西门子公司)；CFX384Touch型实时荧光定量PCR仪(美国伯乐公司)。

1.2实验动物及分组 选取清洁级SD大鼠80只，10～12周龄，体重230～270 g；湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0003，动物使用许可证号：SYXK(湘)2019-0012，动物质量合格证号：2019L00173。随机分为对照组、模型组、强骨胶囊组、槲皮素低、高剂量组，每组16只，自由摄取饲料、饮水，自动控制昼夜循环(12/12 h)，室温(22±1)℃。

1.3动物建模及给药 模型组、强骨胶囊组、槲皮素低、高剂量组建立大鼠废用性骨质疏松模型：用70%异丙醇清洁大鼠尾部并涂上安息香酊连接到线束装置上，线束装置的另一端连接到笼子顶部的旋转装置，使大鼠的头部向下倾斜30°夹角，防止大鼠的后肢在实验期间的任何时间接触地面，持续4周[12]。对照组无任何处理。从造模第1天开始，强骨胶囊组给予强骨胶囊250 mg/kg[10]灌胃，槲皮素低、高剂量组给予槲皮素100、200 mg/kg[11]灌胃，灌胃体积为10 ml/kg，1/d；对照组及模型组给予等体积生理盐水，1/d；5组均给药4周。

1.4股骨骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分散度测定 在大鼠处死前1天，腹膜内注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠并在标本平台上仰卧，使两后肢分别取弯曲和伸展姿势。通过双能X线吸收测定法测量体内股骨远端的骨密度。将大鼠股骨置于70%乙醇中，显微CT机扫描股骨远端松质骨，能量设置为500 mA和80 kV，分析骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分散度。

1.5股骨ERK1/2、MAPK mRNA水平测定 切下大鼠股骨，以液氮捣碎，并使用Trizol试剂从收获的股骨渣中提取总RNA，采用ReverTra Ace qPCR RT试剂盒将反转录成cDNA。引物由碧云天生物技术研究所合成。引物序列如下：ERK1/2正向：5'-AGCCTTCGTTGCTGTGGAGA-3'，反向5'-TGGTGTCATAAGGATGGTGG-3'；MAPK正向 5'-AGGGTCCTACACATACTTCG-3'，反向5'-GGTCCTTGGTTAGCATTCTC-3'；β-actin正向 5'-CAAACTGCTAAATGACGAGG-3'，反向5'-GGGAAAGGTTGTGTAGGGTC-3'。使用SYBR®GreenRealtime PCR Master Mix试剂盒进行qRT-PCR分析，反应条件是94℃ 30 s，然后95℃，5 s和60℃，30 s；30个循环。2-ΔΔCt法计算ERK1/2、MAPK mRNA的相对表达水平，其中β-actin是内参基因。

1.6股骨ERK1/2、MAPK蛋白水平测定 将大鼠股骨在液氮中研磨，放射免疫沉淀缓冲液裂解蛋白质，使用Nuclear Extract Kit试剂盒提取核蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定分离的蛋白质浓度。SDS-PAGE电泳分离100 mg蛋白质，转移至硝酸纤维素膜；在5%脱脂乳中封闭后，将膜与ERK1/2(1∶1000)、MAPK(1∶1000)、β-actin(1∶1000)一抗孵育，在4℃过夜。然后与辣根过氧化物酶缀合的二抗(1∶5000)孵育2 h。增强的化学发光试剂盒显示蛋白印迹，使用ImageQuant LAS 4000型化学发光成像分析仪成像。

2 结果

2.1股骨骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分散度的比较 与对照组比较，模型组股骨骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度显著降低，骨小梁分散度显著升高(P<0.05)。与模型组比较，强骨胶囊组、槲皮素低、高量组股骨骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度显著升高，骨小梁分散度显著降低(P<0.05)。与槲皮素低剂量组比较，强骨胶囊组和槲皮素高剂量组骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度升高，骨小梁分散度降低(P<0.05)。槲皮素高剂量组与强骨胶囊组股骨骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分散度比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 5组大鼠股骨骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分散度的比较

2.2股骨骨小梁结构及数量比较 对照组股骨骨小梁结构正常，数量较多，且相互连接成网状结构；模型组股骨骨小梁结构疏松、数量较对照组明显减少，且各骨小梁互相独立、网状结构减少；槲皮素低剂量组骨小梁结构较模型组变化不明显；强骨胶囊组及槲皮素高剂量组骨小梁结构较模型组密集，数量增加，且网状结构也增加。见图1。

2.3股骨ERK1/2、MAPK mRNA表达水平比较 与对照组比较，模型组股骨ERK1/2 mRNA、MAPK mRNA表达显著升高(P<0.05)。与模型组比较，强骨胶囊组、槲皮素低、高剂量组股骨ERK1/2 mRNA、MAPK mRNA表达水平显著降低，且槲皮素高剂量组与强骨胶囊组低于槲皮素低剂量组(P<0.05)。槲皮素高剂量组与强骨胶囊组股骨ERK1/2 mRNA、MAPK mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 5组大鼠股骨ERK1/2 mRNA和MAPK mRNA表达水平比较

2.4股骨ERK1/2、MAPK蛋白表达水平比较 与对照组比较，模型组股骨ERK1/2、MAPK蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较，强骨胶囊组、槲皮素低、高剂量组股骨ERK1/2、MAPK蛋白表达水平降低，且槲皮素高剂量组和强骨胶囊组低于槲皮素低剂量组(P<0.05)。槲皮素高剂量组与强骨胶囊组股骨ERK1/2、MAPK 蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图2。

图2 5组大鼠股骨ERK1/2、MAPK蛋白印迹图

表3 5组大鼠股骨ERK1/2、MAPK蛋白表达水平比较

3 讨论

骨是通过有机基质矿化连续形成的更新组织。成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收平衡被破坏会导致骨质疏松症等骨病。废用性骨质疏松症是一种常见的骨质疏松疾病。槲皮素在自然界中广泛存在，是一种具有许多药理活性的类黄酮；可消除自由基，抗病毒及保护心血管；还可预防过氧化氢诱导的成骨细胞功能障碍[13]。槲皮素是一种黄酮类化合物，可有效促进MC3T3-E1细胞的成骨细胞分化[14]，可抑制RAW264.7细胞中的破骨细胞生成。在动物骨质疏松实验中，将大鼠切除卵巢60 d并给予不同剂量的槲皮素，结果表明槲皮素可以改善大鼠骨密度，逆转海绵骨的微观结构，提高生物力学性能；同时，槲皮素可以上调其成骨细胞并下调破骨细胞的能力[15]。本研究结果显示，与模型组比较，强骨胶囊组、槲皮素低、高剂量组股骨骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度明显升高，骨小梁分散度明显降低；且槲皮素高剂量组和强骨胶囊组骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度高于槲皮素低剂量组，骨小梁分散度低于槲皮素低剂量组。模型组股骨骨小梁结构疏松、数量较对照组明显减少，且各骨小梁互相独立、网状结构减少；强骨胶囊组及槲皮素高剂量组骨小梁结构较模型组密集，数量增加，且网状结构也增加。这说明槲皮素能显著改善骨小梁结构数量，增加骨密度，预防废用性骨质疏松。

MAPK蛋白通过与受体复合物(Frizzled和LRP5/6)结合，导致细胞溶质复合物失活、β-连环蛋白降解。β-连环蛋白可以在细胞质中积累，然后易位到细胞核中，从而促进骨骼中特定基因的表达，最终导致成骨细胞分化减少并促进破骨细胞生成[16-17]。ERK1/2是骨和骨髓中最丰富的p38成员，并且在生理性骨稳态中具有重要作用。选择性ERK1/2抑制剂可预防雌激素戒断导致的骨质消耗[18]。有研究报道，与野生型同窝小鼠相比，由于机械刺激引起的骨形成增加在ERK1/2-MAPK信号激活的突变小鼠中消失，导致骨量减少；并且通过尾部悬浮机械卸载，降低了ERK1/2-MAPK蛋白信号传导的活性[19]。槲皮素抑制ERK1/2-MAPK信号传导对去卵巢小鼠骨质疏松有明显改善作用[20]。本研究结果显示，模型组股骨ERK1/2 mRNA和蛋白表达水平、MAPK mRNA和蛋白表达水平均高于对照组，且强骨胶囊组、槲皮素低、高剂量组低于模型组，且槲皮素高剂量组和强骨胶囊组低于槲皮素低剂量组。这与上述讨论一致，提示槲皮素可抑制ERK1/2、MAPK mRNA和蛋白的表达，进而抑制ERK1/2-MAPK信号通路的传导。

综上所述，槲皮素能显著改善骨小梁结构数量，增加骨密度，可预防废用性骨质疏松；其机制与槲皮素可抑制ERK1/2、MAPK mRNA和蛋白的表达，进而抑制ERK1/2-MAPK信号通路的传导有关。