蓝光对维甲酸致骨质疏松大鼠的影响

陆珉成， 李英华， 费文超， 徐天元， 徐 可， 童文卿， 洪 洋

复旦大学附属上海市第五人民医院骨科，上海 200240

蓝光是一种波长为400～500 nm的可见光，常被应用于临床[1-2]。蓝光光子可被皮肤中的胆红素吸收，进而通过光化学反应将胆红素转换为可被肾脏和肝脏排泄的异构体，产生类似于药物剂量反应的效应，常被用于治疗新生儿黄疸[3]。蓝光可诱导活性氧的产生，活化丙酸杆菌中的卟啉，促使丙酸杆菌死亡，从而抑制痤疮的发生[4]；也可用于治疗幽门螺杆菌感染[2]和念珠菌阴道炎[5]。蓝光可联合5-氨基酮戊酸或其甲酯化产物，治疗光线性角化病患者的皮肤损害[6]。蓝光照射伤口可诱导细胞色素氧化酶和线粒体血红蛋白释放NO，有效激活NO抑制的线粒体[7]，同时蓝光被血红蛋白吸收后会引起局部温度升高，诱发凝血效应，从而促进伤口愈合[8]。此外，蓝光可通过调整人体生物钟的昼夜节律，抑制体内褪黑素的产生，改善帕金森患者的情绪和睡眠障碍[9]，降低季节性情感障碍的发病率[10]。

蓝光与骨代谢的关系一直是骨科领域的关注热点[11-13]。Yuan等[11]的实验结果显示，蓝光会抑制骨髓间充质干细胞增殖，促使凋亡，抑制成骨分化。Notomi等[12]的研究显示，蓝光刺激可提高RAW264.7细胞的抗酒石酸盐酸性磷酸酶活性及促进破骨分化。Dereci等[13]利用蓝光照射颅骨缺损大鼠模型的骨膜，发现LED蓝光能促进骨生成。然而目前关于蓝光对骨的影响在细胞层面的研究结果不一致。因此，本研究从动物水平研究蓝光干预对维甲酸致骨质疏松模型骨代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 9月龄SPF级健康雌性SD大鼠24只，体质量(370±37)g，由华东师范大学动物实验中心提供[动物质量许可证号：SYXK(沪)2016-0010]。将大鼠随机分为正常组、模型组、蓝光1组和蓝光2组，每组6只，每笼3只，分笼饲养在室温20～28℃、相对湿度60%～80%、通风良好的清洁环境中，自由饮水，用专用鼠粮喂养。本研究通过复旦大学动物伦理委员会批准(2019五院JS-043)。

1.2 主要试剂与仪器 维甲酸(98%，上海善然生物科技有限公司)，大鼠ALP ELISA(96T)试剂盒、大鼠β-CTX ELISA(96T)试剂盒、大鼠P1NP ELISA(96T)试剂盒均购自武汉贝莱茵生物科技有限公司，水合氯醛、无水乙醇(化学纯)购自中国医药集团上海化学试剂有限公司。钙检测试剂盒、磷检测试剂盒均购自贝克曼库尔特中国有限公司。其他包括全自动生化分析仪(CX5，Beckman公司，美国)，酶标仪(Epoch，BioTek公司，美国)，MicroCT仪(SKYSCAN 1275，Bruker公司，德国)，恒温水浴箱(ST-RT-V50，上海一恒科技有限公司)，冰箱(-86℃，DW-86L828型，海尔集团)，低温离心机(5920R，Eppendorf公司，德国)，460 nm LED蓝光灯(复旦大学信息学院光源与照明工程系定制)。

1.3 给药和干预方法 维甲酸用超纯水超声溶解。模型组和蓝光组大鼠每天用100 mg/kg维甲酸连续灌胃14 d，正常组大鼠给予同体积的蒸馏水灌胃14 d。14 d后停止药物干预，恢复正常的饮食、饮水。造模过程中，各组均采用正常的日光灯照明。造模结束后，正常组和模型组采用正常光照，日光灯控制昼夜(12 h∶12 h )；蓝光组采用460 nm的LED蓝光灯控制昼夜(12 h∶12 h )，光照强度(30 000±2 000)Lux。蓝光1组(蓝光干预14 d)造模结束后第1周采用日光灯光照，第2～3周用LED蓝光灯照明；蓝光2组(蓝光干预21 d)造模后第1～3周均采用蓝光光照。非蓝光照射时日光灯照射补齐至总照射天数(35 d)。采用干预开始时间不同、截止时间相同的方法来控制实验结束时实验大鼠的条件一致性。

1.4 血清学指标测定 光照结束时，所有大鼠按0.5 mL/100 g腹腔注射4%水合氯醛麻醉后，称质量，用促凝管采眼眶静脉血1.5 mL，3 500r/min，4℃离心10 min，取血清，按照试剂盒说明书检测血清钙、磷、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、β-胶联降解物(β-bonded degradation products，β-CTX)和Ⅰ型前胶原氨基端肽(amino terminal peptide of procollagen type 1，P1NP)等指标。钙、磷检测采用化学发光法，ALP、β-CTX和P1NP检测采用ELISA法。

1.5 骨密度及骨微结构测定 所有大鼠用CO2麻醉处死后取股骨，去除筋膜，0.9%氯化钠液冲洗净后采用滤纸吸干表面水分，将样本置于microCT扫描仪样本室，设置扫描参数为60 kV、166 μA，扫描精度为18 μm，扫描时间为30～40 min。扫描完成后，利用扫描仪自带软件对扫描数据进行3D重建，选定股骨样本靠近膝关节段的区域，进行数据分析与统计，获取骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁分离度。每个样本平均扫描3次，取平均值。

2 结 果

2.1 ALP、β-CTX和P1NP工作曲线的建立 根据ALP、β-CTX和P1NP的试剂盒说明，以标准品浓度为横坐标、对应D值为纵坐标得到各工作曲线。ALP的计算公式：y=0.0279x+0.0342；β-CTX的计算公式：y=0.0092x-0.0609；P1NP的计算公式：y=0.0296x+0.0616。将测定的大鼠血清各指标的D值带入上述相应的工作曲线公式，得到各骨代谢指标的浓度。

2.2 体质量 结果(表1)显示：造模前所有大鼠体质量差异无统计学意义。造模后，与正常组相比，蓝光组和模型组大鼠的体质量显著降低(P<0.01)。光照结束时，蓝光1组、蓝光2组体质量与模型组差异有统计学意义(P<0.01)；正常组和模型组大鼠体质量显著增加，而蓝光1组和蓝光2组体质量持续下降。

表1 各组大鼠造模前后及光照结束时体质量对比 n=6；，g

2.2 钙、磷水平 结果(表2)显示：模型组血钙低于正常组，血磷高于正常组(P<0.01)。与模型组相比，蓝光组的血钙水平降低、血磷水平升高(P<0.01)。蓝光1组和蓝光2组的血钙、血磷的水平差异无统计学意义。

2.3 骨代谢标志物水平 结果(表2)显示：模型组ALP、β-CTX、P1NP均高于正常组(P<0.01)。与模型组相比，蓝光1组ALP、β-CTX和P1NP下降(P<0.05)，蓝光2组ALP、P1NP、β-CTX也均下降(P<0.01)。蓝光1组和蓝光2组ALP和P1NP水平差异均无统计学意义(P=0.193、P=0.264)，蓝光2组β-CTX水平较蓝光1组下降(P=0.024)。

表2 各组大鼠钙、磷水平和骨代谢标志物水平比较 n=6，

2.4 骨密度和骨微结构比较 结果(表3)显示：与模型组相比，正常组骨密度较高(P<0.01)，蓝光1组骨密度无明显改变(P=0.083)，蓝光2组骨密度下降(P=0.023)；蓝光1组和蓝光2组骨密度差异无统计学意义(P=0.548)。模型组的骨小梁数量少于正常组(P<0.01)；蓝光1组和蓝光2组骨小梁数量均少于模型组(P<0.01)；蓝光1组骨小梁数量少于蓝光2组(P<0.01)。模型组骨小梁厚度小于正常组(P<0.01)；蓝光1组、蓝光2组骨小梁厚度均小于模型组(P<0.01)；蓝光1组和蓝光2组骨小梁厚度差异无统计学意义(P=0.275)。模型组骨小梁分离度大于正常组(P<0.01)；蓝光1组骨小梁分离度大于模型组(P<0.01)；蓝光2组骨小梁分离度较蓝光1组增加(P<0.01)。结果(图1)显示：蓝光2组的骨微结构破坏程度大于模型组，模型组的骨微结构破坏程度大于正常组。

表3 各组大鼠骨密度及骨微结构比较 n=6，

图1 各组大鼠模型的股骨图对比

3 讨 论

体质量指数与骨质疏松强度相关[14]。本研究发现，在光照期间正常组大鼠体质量平均增加12.50 g，模型组平均增加13.41 g，蓝光组平均减少5.39 g，说明蓝光干预能降低骨质疏松模型大鼠的体质量，而通过影响体质量促进骨质疏松可能是蓝光影响骨密度的原因之一。Yuan等[11]的实验结果显示，蓝光可抑制骨髓间充质干细胞增殖，促使其凋亡。因此推测蓝光影响体质量可能与其抑制骨髓间充质干细胞的增殖进而使其成脂分化受到影响有关，这有待于进一步深入研究。

低钙和高磷水平能抑制成骨细胞活性、促进破骨细胞活化[15]。本研究中，蓝光干预能降低血清钙、增加血清磷的水平，且这种改变在干预14 d时已经发生变化，14 d和21 d的变化差异无统计学意义，说明蓝光干预影响钙磷代谢水平发生在骨质疏松早期，骨代谢失衡到一定程度后发生骨代偿性补偿，即通过动员骨骼中的钙磷来维持血液中的钙磷代谢平衡，这与后期的骨密度下降现象相符合，推测蓝光对骨密度的影响和钙磷代谢水平失衡有一定的相关性。

ALP和P1NP是临床和基础研究中常用的反映成骨活性的骨标志物，β-CTX是常见的破骨细胞活性标志物[16]。本研究中，ALP、β-CTX和P1NP均在蓝光干预14 d发生变化，且蓝光干预早期对ALP和P1NP产生的影响比β-CTX显著，提示蓝光干预抑制成骨的作用要早于抑制破骨的作用。蓝光干预早期骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁分离度发生变化，而骨密度的变化晚于骨小梁的变化，这与临床上骨质疏松人群在早期先发生骨小梁减少和骨分离度增加的现象[17]相符合。本研究中蓝光干预降低ALP和P1NP水平与Yuan等[11]的体外实验中蓝光抑制成骨分化相一致，但降低β-CTX与Notomi等[12]的实验中蓝光刺激可提升RAW264.7细胞抗酒石酸盐酸性磷酸酶活性及促进破骨分化相反。因此，后期需对蓝光降低β-CTX的作用机制进行进一步探索。

蓝光对正常大鼠与低转换型骨质疏松模型作用是否相同还需进一步探索。460 nm是目前LED灯常用的波长，本研究采用的光照强度根据细胞实验结果换算到动物得来，而现实生活中暴露在多大强度、多少时长的蓝光环境才会影响机体的骨代谢还有待于进一步观察。

综上所述，本研究初步探索了蓝光对维甲酸诱导骨质疏松模型的影响，发现蓝光能在早期降低骨质疏松大鼠的体质量、引起钙磷代谢失衡、降低骨密度、破坏骨微结构，加速骨质疏松进展，提示骨质疏松患者在日常生活中须减少蓝光环境暴露。