农田环境中农药残留比例型荧光传感系统研究

徐霞红 权浩然 何开雨 王 柳 王新全 王 强

(浙江省农业科学院农产品质量标准研究所， 杭州 310021)

0 引言

农业生产中各种投入品的大量使用及工业生产中污染物大量排放带来的农产品化学污染物残留问题不容忽视。有机磷农药(OPPs)是一类广泛应用于防治植物病虫害的农药，是果蔬农产品中存在的典型化学污染物[1]。OPPs的半衰期较长，使用不当会导致在农产品、环境和水中残留严重。OPPs对乙酰胆碱酯酶(AChE)活性具有不可逆的抑制能力，干扰人体重要器官的功能，最终导致呼吸麻痹、中毒[2]。水中存在的有机磷农药残留主要来自田间喷洒农药，雨水的冲洗使农药渗透进入水渠、河流及地下水中。水是人类赖以生存的重要自然资源，水体的破坏对人类等生物体产生极大的伤害[3]。因此，监测农业环境中有机磷农药残留对从种养源头管控农产品安全具有重大意义。

目前，OPPs常用的检测方法有液相色谱、气相色谱、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用等依赖大型仪器的实验室精准监测手段[4-6]，大型仪器难以携带，在农业环境现场快速监测中应用受限。国内外应用于农药残留快速检测的主流技术为酶抑制法和免疫法，分别使用胆碱酯酶和抗体作为分子识别探针[7-9]。基于免疫法的快检技术利用抗原-抗体间的特异性分子识别而建立，特异性强、商品化技术成熟。但是由于农药分子量偏小，抗体创制难、不易获得，并且农药种类繁多，无法通过免疫分析解决其他无抗体农药及多残留同时检测的问题。我国现阶段普遍采用的农残速测仪和速测卡基于乙酰胆碱酯酶抑制作用而建立的快速分析技术，能在较短时间内完成大量样品的初筛，但酶活性有时会受到一些农产品基质成分的抑制，易产生假阳性，对有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限均为mg/kg级别，对含量更低、一些国家强制禁用及高毒的农药(甲基对硫磷、对硫磷、毒死蜱等)则不能检出。因此，开发新型检测技术与仪器、提高检测灵敏度和可靠性是目前快速检测农药残留、降低食品安全风险和进行早期预警的关键。

荧光检测具有灵敏度高、简单、高效等优势，其中比例型荧光检测抗干扰能力强，不受荧光探针浓度影响，可实现可视化检测。荧光金属-有机框架材料(Metal-organic frameworks, MOFs)具有孔隙度高、比表面积大、纳米空腔效应等优势，可通过吸附和包埋的方式固定与富集大量分子，也易合成与修饰[10]，是构成比例型荧光体系的优势材料[11]。荧光MOFs的独特多孔性利于富集反应物、增加反应位点，其优异的包埋和后修饰能力能灵活包埋其他荧光探针或蛋白等物质，结合自身性质，可望集成识别-信号输出功能构建化学传感系统。已有研究表明，MOFs能针对某些农药残留产生特异性荧光淬灭效应，在2 min内实现甲基对硫磷、对硫磷的现场快速检测，并能在果蔬样品上实现原位荧光成像分析[12-14]。

本文基于锆离子和1,2,4,5-四(4-羧苯基)苯(H4TCPB)合成蓝色荧光MOFs材料Zr-TCPB，并与红色荧光量子点QDs(荧光发射峰Em为625 nm)组装成双荧光QDs@MOFs复合物，基于Zr-TCPB对有机磷农药的特异性荧光淬灭效应，构建比例型荧光化学传感器系统，以期实现有机磷农药的快速、灵敏、可视化检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

氯化锆(ZrCl4)、1,2,4,5-四(4-羧苯基)苯(H4TCPB)购自Sigma Aldrich公司。苯甲酸和二甲基甲酰胺(DMF)购自生工生物技术公司，羟基水溶性量子点QD-625(红色荧光)购自武汉珈源量子点技术开发有限责任公司，有机磷农药标准品如内吸磷、三唑磷、治螟磷、灭线磷、甲基异柳磷、氧乐果、水胺硫磷、甲胺磷、甲拌磷、马拉硫磷、蝇毒磷、苯线磷、特丁硫磷、地虫磷等均购于北京北方伟业计量技术研究院。采用微孔板检测仪Gene5(美国伯腾)记录荧光光谱以及紫外-可见光谱。采用SU8010型场发射扫描电子显微镜(日立公司，日本)和FEI Tecnai G2 F20型高分辨场发射透射电子显微镜(FEI公司，美国)获得扫描电子显微镜(SEM)及透射电子显微镜(TEM)图像。

1.2 实验方法

1.2.1材料合成

Zr-TCPB的制备：将H4TCPB 50 mg，氯化锆70 mg，苯甲酸2 700 mg，DMF 20 mL与水10 mL超声混合15 min，放入聚四氟乙烯反应釜中在120℃条件下反应24 h，自然冷却后用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，在60℃条件下干燥12 h，得白色粉末状Zr-TCPB材料。

QDs@MOFs的制备：取适量的Zr-TCPB溶于水中，超声混合均匀后加入QDs再超声混合，高速离心去上清液，用超纯水洗涤3次，干燥备用。

1.2.2荧光检测

取上述备用QDs@MOFs分散液使用PBS(0.1 mol/L，pH值为6.0)稀释一定质量浓度后，取10 μL QDs@MOFs分散液，加入一定质量浓度(0.005～2 mg/L)的90 μL有机磷农药，混匀后在微孔板检测仪中检测荧光强度。在特异性探讨实验中，将10 μL QDs@MOFs与90 μL不同种类的农药(均为0.25 mg/L)：甲基对硫磷、对硫磷、内吸磷、三唑磷、治螟磷、灭线磷、甲基异柳磷、氧乐果、水胺硫磷、甲胺磷、甲拌磷、马拉硫磷、蝇毒磷、苯线磷、特丁硫磷、地虫磷进行混合，以PBS为空白对照，混匀3 min后在微孔板检测仪中检测荧光强度。

2 结果与分析

2.1 材料表征

Zr4+和H4TCPB在热溶剂条件下最终制得白色粉末状Zr-TCPB MOFs材料，在254 nm紫外激发波长条件下产生强烈的蓝色荧光，而QDs@MOFs由于包裹了红色荧光QDs-625，荧光表现出强紫红色(图1a)。图1b为Zr-TCPB和QDs@MOFs的SEM及TEM表征图，电镜图表明Zr-TCPB为片状晶体聚集而成的花朵形貌，平均尺寸在0.9 μm左右，QDs@MOFs由于包裹了QDs，表面片层变为颗粒形貌，从图1b可以看出，MOFs复合材料中已嵌入大量的QDs颗粒。

图1 MOFs材料的形貌表征图Fig.1 Morphology pictures of MOFs materials

2.2 条件优化

一定质量浓度(0.1 mg/L)的甲基对硫磷与QDs@MOFs混合后，立即置于微孔板检测仪中读取254 nm激发下的400 nm处荧光强度。淬灭效率计算式为

Q=(I0-It)/I0×100%

(1)

式中I0——初始发射峰强度

It——加入甲基对硫磷后的发射峰强度

如图2所示，随着时间的增加，荧光强度在2 min内下降迅速，并在3 min后达到平衡，说明农药对MOFs的荧光淬灭作用在3 min能完成并达到稳定状态，因此，后续实验选择3 min作为最佳反应时间。另一方面，为实现对有机磷农药的灵敏检测，QDs@MOFs的浓度优化通过甲基对硫磷与不同质量浓度的QDs@MOFs复合物溶液混合后的荧光变化来实现。如图3所示，随着QDs@MOFs质量浓度的增加，400 nm荧光淬灭程度先增加后降低，在QDs@MOFs的质量浓度为25 μg/mL时，淬灭效率达到最高，后续实验选用QDs@MOFs的最佳质量浓度为25 μg/mL。

图2 荧光动力学曲线Fig.2 Fluorescence kinetics curve

图3 不同QDs@MOFs质量浓度下的荧光淬灭效率Fig.3 Fluorescence quenching efficiency at different concentrations of QDs@MOFs

2.3 比例型荧光分析

QDs@MOFs复合材料具有2个荧光发射峰，分别为Zr-TCPB蓝色荧光与QDs的红色荧光。由于甲基对硫磷对Zr-TCPB的荧光淬灭作用，导致QDs@MOFs的蓝色荧光(发射峰400 nm)强度降低，通过蓝色荧光与红色荧光变化的比例，可计算出甲基对硫磷的残留水平，从而建立基于QDs@MOFs双色比例型荧光分析的农药定量传感体系。如图4a所示，当加入不同质量浓度(0～2 mg/L)的甲基对硫磷后，随着农药质量浓度增加，QDs@MOFs在400 nm处的荧光发生显著降低，QDs在625 nm处荧光也有下降趋势，总体上荧光强度随着农药质量浓度的增加而降低，最终表现出由强紫红色向弱红色荧光转变。相类似的，甲基对硫磷可淬灭Zr-TCPB的蓝色荧光，因此所得到的数据与甲基对硫磷类似(图4b)。依据农药质量浓度与荧光强度的对应关系，得到甲基对硫磷和对硫磷的检测标准曲线，如图4c所示，淬灭效率随甲基对硫磷、对硫磷的对数质量浓度增加而增加。线性拟合方程分别为

y=31.424x+84.191 (R2=0.993 0)
y=34.564x+83.76 (R2=0.990 3)

线性范围为0.005～2 mg/L，最低检测限(LOD)计算公式为

LOD=3N/S

式中N——最低质量浓度农药下响应的标准偏差

S——校准曲线斜率

计算得到甲基对硫磷的LOD为1.9 μg/L，对硫磷的LOD为4.9 μg/L。本研究开发的QDs@MOFs双色比例型荧光传感器对甲基对硫磷、对硫磷的检测灵敏度优于已报道的同类型传感器，具体数据如表1所示。

图4 荧光响应光谱图Fig.4 Fluorescence response spectra

表1 QDs@MOFs荧光传感器的检测性能与文献方法对比Tab.1 Detection performance of QDs@MOFs fluorescence sensor compared with that of other literature methods

图5 特异性分析Fig.5 Specificity analysis

2.4 特异性分析

为了进一步探讨QDs@MOFs荧光传感器对农药残留检测的特异性，选用了16种代表性的国家禁限用有机磷农药，分别为内吸磷、三唑磷、治螟磷、灭线磷、甲基异柳磷、氧乐果、水胺硫磷、甲胺磷、甲拌磷、马拉硫磷、蝇毒磷、苯线磷、特丁硫磷、地虫硫磷、对硫磷、甲基对硫磷，在相同检测条件下，QDs@MOFs荧光传感器对相同质量浓度(0.25 mg/L)的农药反应并进行了荧光测定。如图5所示，除了对硫磷、甲基对硫磷外，其余14种有机磷农药并未导致QDs@MOFs出现显著的荧光大幅度降低或增强现象，其中蝇毒磷和苯线磷表现了稍微的荧光强度降低。对硫磷、甲基对硫磷产生如此大幅度的荧光淬灭效应，主要是由于甲基对硫磷和对硫磷中硝基苯基对Zr-TCPB的荧光能量转移作用导致的淬灭作用。上述结果表明，QDs@MOFs荧光传感器对甲基对硫磷与对硫磷的检测具有较高的特异性。

2.5 实际环境水样分析

为了进一步探讨QDs@MOFs荧光传感器对农药残留检测的实际应用能力，采用环境水样标准添加法，测定样品中甲基对硫磷及对硫磷的含量，通过浓度检测比对及回收率分析，探讨QDs@MOFs荧光传感器的实际样品检测能力。将不同质量浓度的甲基对硫磷及对硫磷(0.01、0.1、1 mg/L)添加至河水、自来水及田间水中，3 min后检测QDs@MOFs的荧光强度，根据线性标准曲线分析得到农药残留的质量浓度，平行分析3组数据，计算回收率。如表2所示，甲基对硫磷回收率在93.23%～116.41%，平均相对标准偏差(RSD)为5.29%，对硫磷回收率在92.52%～107.83%，平均RSD为5.74%，上述结果表明，QDs@MOFs荧光传感器具有良好的可靠性，可适用于实际环境水样中的甲基对硫磷及对硫磷分析。

表2 实际样品中甲基对硫磷和对硫磷的检测结果Tab.2 Detection results of real samples

3 结论

(1)开发了一种比例型荧光QDs@MOFs复合材料，可通过荧光响应用于检测甲基对硫磷及对硫磷两种有机磷农药，其响应速度快，能在3 min完成检测分析。

(2)由于MOFs的高吸附性能，使得分析物与MOFs的接触更加充分，从而提高了检测效率；同时由于红色荧光量子点的引入，可通过荧光颜色的变化直观判断甲基对硫磷及对硫磷两种有机磷农药的残留水平。该荧光传感器是一种高灵敏度的农药残留快速检测仪器。

(3)甲基对硫磷与对硫磷的检测限分别为1.9 μg/L和4.9 μg/L，线性检测范围为0.005～2 mg/L，该荧光传感器对甲基对硫磷及对硫磷具有良好的特异性检测能力。

(4)该荧光分析法能有效用于农业环境水样中甲基对硫磷及对硫磷的现场快速测定，在环境样品农药的快速监测方面具有巨大的应用价值。