右美托咪定对肺叶切除术患者肺组织炎症反应和细胞焦亡相关因子的影响

辛苗 张春光 于京福 代汭 万效梅 王燕 王晓

胸外科手术通过双腔气管实现的单肺通气（OLV）会导致通气血流比值失调、肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞的损伤，从而造成肺间质和肺泡水肿，临床表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫，其发展到严重阶段称为急性呼吸窘迫综合征[1]。OLV引发急性肺损伤的机制包括中性粒细胞的活化、炎症反应、细胞凋亡和T细胞失衡[2]，如何减轻OLV引起的肺损伤是当今临床医生研究的热点问题。右美托咪定是一种高度选择性α2受体激动剂，可用于ICU患者短期和长期镇静[3]。有研究表明，右美托咪定可减轻脓毒症引起的急性肺损伤[4]。但在目前关于右美托咪定改善OLV引起肺损伤的研究多为小样本、单中心研究，缺乏临床研究的内部真实性。细胞焦亡是组织程序性坏死的另一种形式，可诱导细胞因子的转录、细胞质内巨噬细胞的模式识别受体（PRRs）激活，也可以诱导刺激炎症反应[5]。有研究表明右美托咪定减轻大鼠离体肺缺血再灌注损伤的机制可能与抑制细胞焦亡有关[6]，目前只局限于动物研究；右美托咪定是否通过细胞焦亡机制减轻肺叶切除术患者OLV引起的急性肺损伤，国内外尚未见相关研究。本研究拟评价右美托咪定对肺叶切除术患者肺组织炎症反应和细胞焦亡相关因子的影响，进一步明确右美托咪定减轻肺损伤的作用机制。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018年11月至2019年11月青岛大学附属医院210例、青岛市市立医院228例需行胸腔镜肺叶切除术患者共438例，男221例，女217例，ASA分级Ⅰ 或Ⅱ级，年龄30～70岁，体重50～80 kg。采用随机数字表法分为对照组（C组）和右美托咪定组（D组），每组219例。纳入标准：（1）心力衰竭分级（NYHA分级）Ⅰ或Ⅱ级；（2）无脑外伤、脑出血、脑梗死病史；（3）肝肾功能正常；（4）近期无酗酒滥用药物史；（5）既往无精神心理疾病病史，且近期未服用抗精神病药物；（6）手术时间120～180 min；（7）患者知情且愿意配合试验。排除标准：（1）NYHA 分级Ⅲ～Ⅳ级；（2） 术前肺功能严重下降（PaO2＜60 mmHg或用力呼气量＜50%）；（3）凝血功能异常或血小板减少；（4）既往曾接受放疗、化疗或免疫治疗；（5）全身或局部感染（包括C反应蛋白升高、白细胞增多或体温＞38℃）；（6）患者中途拒绝继续配合试验或者死亡；（7）围术期发生严重的不良事件，如心律失常、气道插管困难、过敏性休克等。C组手术暂停7例，不同意参与本研究5例，术中出现大出血8例恶性心律失常4例，术后1 d心脏停搏2例，最终纳入193例。D组手术暂停5例，不同意参与本研究4例，术中出现大出血8例、恶性心律失常9例，术后1 d体温＞38℃3例，最终纳入190例。两组患者一般资料比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表l。本研究经青岛市市立医院伦理委员会批准，所有患者均提供书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 麻醉方法 患者入手术室后开放动静脉，连接心电监护。D组于麻醉诱导前10 min经静脉输注右美托咪定（江苏恒瑞医药股份有限公司）负荷剂量1.0 μg/kg，随后以0.3 μg/（kg·h）的速率静脉输注至术毕前30 min，C组以同样方式静脉输注等容量0.9%氯化钠注射液。麻醉诱导采用靶控输注异丙酚，初始浓度1.0 μg/ml，逐步增加到 0.3 μg/ml，直到脑电双频指数（BIS）值 40～55，静脉注射咪达唑仑0.03 ml/kg、舒芬太尼0.5 μg/kg和罗库溴铵0.9 mg/kg。麻醉诱导后行双腔气管导管插管术，采用纤维支气管镜确定双腔气管导管位置，气管插管完成后，潮气量8 ml/kg，吸气与呼气比为1∶2，呼吸频率为8次/min。持续输注丙泊酚4～8 mg/（kg·h）、瑞芬太尼0.1～0.2 μg/（kg·min）和顺阿曲库铵0.3～0.4 mg/kg维持麻醉，维持BIS值40～60。手术前将通气模式改为OLV，调整呼吸频率和潮气量以维持脉搏血氧饱和度和呼吸末二氧化碳分压。患者恢复自主呼吸拔管后进入麻醉后监护病房（PACU），Steward评分＞4后离开PACU。术中应保持患者血流动力学稳定，术毕均连接13960自控镇痛泵（美国Abbott公司）行静脉自控镇痛（PCIA），维持静态视觉模拟评分法（VAS）＜3分，镇痛药配方：酒石酸布托啡诺注射液10 mg，用0.9%氯化钠注射液稀释到100 ml，负荷量为2 ml，背景输注速率为2 ml/h，PCIA剂量为0.5 ml，锁定时间为15 min。

表1 两组患者一般资料的比较

在麻醉的影响下，平均动脉压（MAP）低于基线20%或MAP＜60 mmHg持续超过30 s为低血压，予去氧肾上腺素40 μg。静脉注射阿托品0.3 mg治疗心动过缓（心率＜60次/min）。

1.2.2 肺组织采集及测定 术中距离病变区8 cm以上获取4 mm×4 mm×4 mm肺组织标本3份，-80℃冰箱保存，采用Western blot法检测肺组织消皮素D（GSDMD）、NOD 样受体家族蛋白 3（NLRP3）、凋亡相关微粒蛋白（ASC）和半胱天冬酶-1（Caspase-1）的表达。取1份肺组织标本按照每20 mg组织加200 μl裂解液，超声裂解，4℃离心后取上清液，12 000 r/min 3～5 min，BCA法测定蛋白浓度，加入5×上样缓冲液100℃变性5 min，-20℃冻存电泳完毕将胶上的蛋白转移到PVDF膜（美国Millipore公司）上，然后用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，取出膜，于摇床上用TBST洗膜5 min×3次。孵育袋中加入封闭液稀释的兔GSDMD多克隆抗体（稀释度 1∶1 000，英国 Biorbyt公司）、兔 NLRP3多克隆抗体（稀释度 1∶1 000，英国 Biorbyt公司）、兔 ASC 多克隆抗体（稀释度 1∶800，美国 Santa Cruz公司）、兔 Caspase-1多克隆抗体（稀释度1∶1 000，英国 Biorbyt公司）、β-actin（稀释度 1∶2 000，美国 Santa Cruz公司），4 ℃孵育过夜。TBST洗膜5 min×3次，辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释度1∶2 000，美国Jackson公司）室温孵育2 h。TBST洗膜15 min×5次。膜于化学发光检测试剂（试剂A∶试剂 B=1∶1）反应 2 min，取出膜，甩去多余的液体，用保鲜膜包好PVDF膜，暗室中用X线胶片感光、显影、定影。采用凝胶图像Image J软件（美国NIH公司）分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参βactin条带灰度值的比值反映其表达水平。

另选1份肺组织称湿重（W）后，将肺组织在电烤箱中以70℃烘烤至恒重，称干重（D），并计算肺组织的干湿重（W/D）值。另1份肺组织经HE染色后用BX41型显微镜（日本Olympus公司）观察，参考文献[7]进行肺组织病理学损伤评分。

1.3 观察指标 （1）记录患者手术过程中出血量（从手术切口到皮肤闭合）、手术时间（从手术切口到皮肤闭合）、OLV 时间。（2）分别于开始 OLV 即刻（T1）、15 min（T2）、30 min（T3）、60 min（T4）和恢复双肺通气 1 h（T5）采集动脉血2 ml进行血气分析并计算氧合指数（OI），OI=PaO2/吸入氧浓度（FiO2）。（3）术后情况：记录术后 48 h 内两组患者肺炎、肺不张的发生情况，记录术后住院时间。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者不同时点OI的比较 与 T1时比较，两组患者 T2～5时 OI均降低（均 P＜0.05）；与 C 组比较，D组 T2～5时 OI升高（P＜0.05），见表 2。

表2 两组患者不同时点OI的比较

2.2 两组患者肺组织病理观察比较 光镜下，C组肺组织炎性细胞浸润、肺泡壁增厚、充血明显。肺泡内可见较多粉红色、均匀的水肿液，见图 1。D组肺泡结构完整，肺泡腔内渗出较少，见图2。

图2 D组肺组织病理检查所见（HE染色，×400）

2.3 两组患者肺组织W/D值和肺病理学损伤评分的比较 与C组比较，D组肺组织W/D值降低（P＜0.05），肺病理学损伤评分降低（P＜0.05），见表3。

2.4 两组患者肺组织GSDMD、NLRP3、ASC和Caspase-1表达的比较 与C组比较，D组肺组织GSDMD、NLRP3、ASC和Caspase1的表达均降低（P＜0.05），见表4和图3。

表3 两组患者肺组织W/D值和肺病理学损伤评分的比较

表4 两组患者肺组织GSDMD、NLRP3、ASC和Caspase-1表达的比较

图3 两组患者肺组织消皮素D（GSDMD）、NOD样受体家族蛋白3（NLRP3）、凋亡相关微粒蛋白（ASC）和半胱天冬梅 -1（Caspase-1）表达电泳图

2.5 两组患者术后肺炎、肺不张、呼吸衰竭发生率及术后住院时间的比较 与C组比较，D组术后肺炎和肺不张发生率降低，术后住院时间明显缩短（均P＜0.05），两组患者术后均未见呼吸衰竭发生。见表5。

表5 两组患者术后肺炎、肺不张、呼吸衰竭发生率及术后住院时间的比较

3 讨论

肺切除手术可引起术后肺部并发症包括肺不张、肺炎和急性呼吸窘迫综合征。呼吸机引起的肺损伤和急性呼吸窘迫综合征是肺切除术后高发病率和高死亡率的主要原因[8]。随着微创技术的应用，OLV已成为胸腔内手术必须的操作手段，有研究发现，OLV与术后肺部并发症有关[9]。另有研究发现，开胸手术后有4%～15%的患者发生急性肺损伤[10]。此外，有研究发现，肺切除手术中使用正呼气末压（PEEP）或持续气道正压（CPAP）≥5 cmH2O，可显著降低急性肺损伤的发病率[11]，因此如何减轻胸科手术引起的急性肺损伤是近年来研究的热点。

NLRP3炎性小体由NLRP3、ASC和Caspase-1组成，这些蛋白具有亲同性相互作用的保守结构域[12]，NLRP3炎性小体可与pyrin结构域（PYD）之间的相互作用为ASC寡聚提供支架，参与炎症的发生过程，发挥促炎作用[13]。ASC蛋白分子包含195个氨基酸残基，是参与细胞凋亡信号转导蛋白[14]。ASC作为细胞中一种重要的连接蛋白，通过Caspase-l活化途径参与并在NLRP3炎性小体的组成中发挥重要作用[15]。Caspase-l可促进GSDMD的裂解和易位，形成膜孔，促进胞内炎性物质的释放，最终导致焦亡。已有研究证实，导致ALI/ARDS的多种内外源性因素可活化NLRP3炎症小体，加重炎症反应[16]。因此本研究观察肺组织GSDMD、NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白含量的变化。

本研究结果显示，使用右美托咪定可使肺病理学损伤评分降低、肺组织W/D值降低，OLV15、30、60 min及恢复双肺通气1 h OI升高，术后肺炎、肺不张的发生率降低，术后住院时间缩短表明右美托咪定可通过减轻肺水肿，改善双肺通气氧合，降低患者术后并发症从而改善OLV肺损伤。此外本研究还发现当使用右美托咪定肺组织 GSDMD、NLRP3、ASC和 Caspase-1表达下调，提示右美托咪定可抑制肺组织细胞焦亡，从而降低炎症反应，减轻肺叶切除术引起的急性肺损伤，其机制可能是右美托咪定通过激活中枢α2肾上腺受体抑制交感神经活性，使体内迷走神经相对兴奋，激活胆碱能抗炎途径，与α7亚基的烟碱样乙酰胆碱受体（α7nAChR）作用发挥抗炎作用，降低血浆中高迁移率族蛋白B1（HMGB1）浓度[17-18]，同时显著降低循环中儿茶酚胺的水平[19]；右美托咪定可阻止肺泡巨噬细胞NF-κB 的核易位和转录降低 IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎性因子浓度[20]，减轻 IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎性因子对肺泡巨噬细胞的应激，减少HMGB1的释放和分泌，减弱炎症级联反应[21]；其次，右美托咪定可能通过刺激α2肾上腺受体亚型增加酪氨酸磷酸化发挥其稳定肺泡巨噬细胞和增加肺泡巨噬细胞可塑性的作用[22]，减少细胞破坏，从而减少HMGB1的释放。HMGB1是人体内非常重要的内源性炎症介质，被鉴定为核非组蛋白DNA结合蛋白，参与核小体的稳定转录的结构和调节。HMGB1从细胞核转移到胞质，然后被释放到细胞外空间，在那里它作为一个典型的DAMP，通过与细胞受体结合来控制炎症功能障碍包括Toll样受体4（TLR-4）。TLR4是HMGB1的主要受体之一，经过TLR4得到一系列的级联，包括髓样分化因子 88（MyD88），是在IRAKs激活后开始的。随后IKK-α/IKK-β导致 IκB-α磷酸化和退化，最终导致激活NF-κB。有研究证实多氯联苯29-pQ（PCB29-pQ）激活NLRP3炎性小体，介导Caspase-1活化，进而促进GSDMD的裂解和易位，形成膜孔，促进胞内炎性物质的释放，最终导致细胞焦亡[23]。有研究提示，HMGB1表达增加能够正反馈调节NLRP3炎症小体而加重急性肺损伤[24]。因此右美托咪定减少肺泡巨噬细胞内HMGB1的释放后降低肺泡巨噬细胞内NLRP3炎症小体，NLRP3炎性小体抑制procaspase1为Caspase-1裂解，从而下调肺泡巨噬细胞内GSDMD的表达从而抑制肺泡巨噬细胞焦亡，改善OLV引起的急性肺损伤。但是右美托咪定改善肺叶切除术由于OLV所引发的急性肺损伤发生、发展的机制复杂，目前尚不能完全预防，仍需多中心、大样本探索其发病机制，为临床预防提供依据。

综上所述，本研究通过多中心、前瞻性、双盲、随机、对照研究发现右美托咪定可通过抑制肺泡巨噬细胞焦亡改善肺叶切除术患者肺组织炎症反应从而减轻急性肺损伤。