白豆蔻挥发油对庆大霉素所致急性肾损伤大鼠中Caspase-3、Bcl-2、Bax及NF-кB p65蛋白表达的影响

程小玲，丰姝姝，张珂*，王航宇，刘博,2，王金辉,3

(1 石河子大学药学院/新疆植物药资源利用教育部重点实验室，新疆 石河子 832002；2 四川大学华西医院/生物治疗国家重点实验室/生物治疗协同创新中心，四川 成都 610041；3 哈尔滨医科大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150081)

白豆蔻收录于2015版中国药典(第一部)，为姜科植物白豆蔻AmomurnkravanhPierre ex Gagnep.或爪哇白豆蔻AmomumcompactumSoland ex Maton.的干燥成熟果实，功能化湿行气、温中止呕、开胃消食，主治湿浊中阻、不思饮食、胸闷不饥、寒湿呕逆、胸腹胀痛、食积不消等症。现代研究中已有白豆蔻粉末对阿霉素肾病模型大鼠的机制研究以及白豆蔻挥发油对糖尿病肾病模型大鼠的保护作用研究，结果表明白豆蔻在治疗肾病方面具有一定的疗效[1-2]。但是对于将白豆蔻挥发油用于庆大霉素所致急性肾损伤机制方面的研究还很少，白豆蔻挥发油作为药典所记录的含量测定成分，对其对庆大霉素所致急性肾损伤进行研究有一定的意义。

庆大霉素是常用抗生素之一，在治疗疾病上具有很好的疗效，但是如果长期使用庆大霉素会出现严重的副作用，各项研究表明连续治疗使用7 d以上的患者极易出现肾毒性[3]，甚至是出现急性肾损伤，这为使用庆大霉素来治疗疾病带来了极大的风险。有研究表明，庆大霉素所致急性肾损伤可能与氧化应激，细胞凋亡，炎症反应，自噬等有关[4]。本研究对白豆蔻挥发油对庆大霉素所致急性肾损伤的作用机制进行了一定的研究，以期为白豆蔻挥发油作为治疗肾病的有效药物提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

健康清洁级Srague-Dawley(SD)雄性大鼠60只，体重在200～250 g之间，购自新疆医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK(新)2016-0001。饲养于温、湿度适宜，通风良好的动物房，自由饮食，实验开始前适应性喂养1周。

1.1.2 药品及主要试剂

白豆蔻(由安国圣山药业有限公司提供，产地：广西)；硫酸庆大霉素注射液(批号：1804164)：河南润红制药股份有限公司；维拉帕米(批号：180201)：天津市中央药业有限公司；一氧化氮合成酶(NOS)(批号：20190226)、肌酐(Cr)(批号：20190307)、一氧化氮(NO)(批号：20190307)、尿素氮(Bun)(批号：20190308)、超氧化物歧化酶(SOD)(批号：20190308)、丙二醛(MDA)(批号：20190308)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)(批号：20190308)、尿蛋白(批号：20190311)测试剂盒：南京建成生物工程研究所；Caspase3抗体(批号：0911412Da9488120)、Bax抗体(批号：13CM400 A)、NF-кB p65抗体(批号：BM3940)、Bcl-2抗体(批号：196841)：博士德公司；β-actin 抗体(批号：16A00205)、山羊抗兔抗体(批号：129256)、山羊抗小鼠抗体(批号：127655)：北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.1.3 仪器

Legend Micro 21R高速冷冻离心机(Thermo Fisher)、GT200震动球磨仪(上海净信)、power wave XS2酶标仪(美国BIO-RAD 公司)、DYCZ-24DN制胶器(北京六一生物科技有限公司)、Axio Imager 2光学显微仪(ZEISS)、CO2培养箱(Thermo Scientific公司)、DYCZ-40D型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 药物制备

白豆蔻挥发油：药材粉碎成粗粉，称取100 g，置于圆底烧瓶中，加5倍量蒸馏水浸泡1 h，按照《中国药典》2015年版挥发油测定法(通则2204甲法)提取制备[5]，置电热套中缓缓加热至沸，保持微沸提取6 h，至白豆蔻挥发油量不再增加为止，静置30 min，得白豆蔻挥发油5.62 mL(得率为5.62%)。将制备好的白豆蔻挥发油置于棕色瓶中，密闭保存，放入4 ℃冰箱中备用。

样品溶液的配制：动物实验前，分别取白豆蔻挥发油0.175、0.35、0.70 mL，加入溶液(0.5%的CMC-Na溶液：2%的吐温-80溶液=5∶1)配制成0.098 4%、0.197%、0.393%的乳剂，折合成生药质量浓度分别为0.312 5、0.625、1.25 g·mL-1，4 ℃条件下保存，临用前摇匀。

1.2.2 动物分组、造模及样本收集

将大鼠适应性饲养一周后随机分为空白对照组、模型组、白豆蔻挥发油低、中、高剂量组及阳性药组(维拉帕米：15 mg·kg-1·d-1)6个组，每组10只，共50只。除空白对照组外，其它各组每天腹腔注射庆大霉素(140 mg·kg-1·d-1)1次，连续7 d，建立急性肾损伤模型。第8天起，均以0.04 mL/10 g给大鼠灌胃给药，空白组和模型组给予0.5%的CMC-Na溶液和2%的吐温-80溶液5∶1混合溶液，白豆蔻挥发油低、中、高各组分别给予低、中、高三种不同浓度的白豆蔻挥发油，阳性药组给予维拉帕米溶液，连续给药28 d。

在实验第7天注射结束后，收集24 h内大鼠尿液，眼眶采血收集大鼠血液。实验第35天，收集24 h内大鼠尿液，腹主动脉收集大鼠血液。处死大鼠，取其两侧肾脏，生理盐水冲洗干净后，滤纸擦干，拍照称重；右肾固定在10%中性福尔马林中。将所有尿液、血清和左肾组织样本置于-80 ℃冰箱中冻存，待测。

1.2.3 指标检测

取尿液及血液样本，对尿蛋白、Scr、Bun含量进行检测；取右肾组织进行苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察；取左肾组织样本，制备10%肾皮质匀浆，对MDA、NO含量及SOD、NOS，GSH-Px活性进行检测；取左肾组织样本，制备肾组织匀浆，提取蛋白，用BCA法进行蛋白质定量，Westem Blot法检测肾组织匀浆中NF-кB p65，Caspase-3，Bax，Bcl-2蛋白的表达，β-actin为内参，Ecl显色，拍照，ImageJ 图像分析软件测定条带的光密度，计算灰度值。

1.2.4 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠急性肾损伤模型的判断

注射庆大霉素7 d后，急性肾损伤模型造模大鼠出现尿蛋白、血清尿素氮(Bun)及血清肌酐(Scr)含量比空白对照组显著增高(P<0.05)，表明连续注射庆大霉素7 d后，大鼠肾脏已受到损伤(表1)。

表1 大鼠血清中Bun、Scr 和尿蛋白含量测定结果 n=8

2.2 白豆蔻挥发油对急性肾损伤大鼠肾体指数及外观的影响

治疗结束后，模型组大鼠肾组织相较于空白对照组大鼠肾组织，肾体指数显著增高(P<0.05)；白豆蔻挥发油各组大鼠相较于模型组大鼠，白豆蔻挥发油中、高各剂量组及阳性药组大鼠肾体指数显著减少(P<0.05)。此外，从图1中可以看出，模型组大鼠肾脏明显增大，而白豆蔻挥发油各治疗组及阳性药组有一定的改善，改善结果有一定的剂量依赖性。各组肾体指数结果见表2。

表2 白豆蔻挥发油对大鼠的肾脏指数的影响 n=8

A—空白对照；B—模型；C—挥发油低剂量；D—挥发油中剂量；E—挥发油高剂量；F—阳性药

2.3 白豆蔻挥发油对急性肾损伤大鼠尿蛋白、Bun及Scr的影响

治疗后对尿液及血清进行检测，结果显示模型组大鼠尿液和血清中尿蛋白、Bun及Scr含量相较空白对照组均显著增高(P<0.05)；白豆蔻挥发油各组相较于模型组，白豆蔻挥发油中、高各剂量组及阳性药组大鼠尿液和血清中尿蛋白、Bun及Scr含量均显著减少(P<0.05)，改善结果有一定的剂量依赖性(表3)。

表3 白豆蔻挥发油对大鼠的尿蛋白、血清尿素氮及血清肌酐的影响 n=8

2.4 HE染色(图2)

图2显示模型组大鼠右肾组织发生了明显的病理变化，肾小管出现高度扩张，严重坏死等；相较模型组，除挥发油低剂量外，其余每组肾小管损伤有所减轻，其中挥发油高剂量组减轻效果最好。

2.5 白豆蔻挥发油对MDA和NO含量，SOD、NOS及GSH-Px活力的影响

肾组织检测结果显示。模型组大鼠肾组织中MDA含量、NO含量和NOS活性相较空白对照组明显增高(P<0.05)，而SOD活性及GSH-Px活性显著下降(P<0.05)。白豆蔻挥发油中、高各剂量组及阳性药组对大鼠肾组织MDA含量、NO含量及NOS活性的升高表现出显著降低，并且对SOD及GSH-Px活性的降低表现出明显的升高作用(P<0.05)，改善结果有一定的剂量依赖性。各组MDA、NO含量及SOD、GSH-Px、NOS活力测定结果见表4。

表4 白豆蔻挥发油对肾组织中MDA、NO含量及SOD、GSH-Px、NOS活力的影响 n=8

2.6 Western blot 实验结果

模型组大鼠肾组织中NF-кB p65，Caspase-3，Bax蛋白表达和空白对照组相比显著增高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)，白豆蔻挥发油中、高各剂量组，及阳性药组与模型组相比NF-кB p65，Caspase-3，Bax蛋白表达显著下降(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)(图3)。

与空白对照相比##P<0.01；与模型组相比**P<0.01,*P<0.05。

3 讨论

庆大霉素作为临床常用的抗生素类药物会引起严重的肾毒性，其能在肾小管上皮细胞和溶酶体等堆积而对代谢造成障碍，导致肾小管受损，甚至引发急性肾损伤[6]。本实验通过腹腔注射庆大霉素导致大鼠出现急性肾损伤来探讨了白豆蔻挥发油对庆大霉素所致急性肾损伤的影响。研究结果显示白豆蔻挥发油可以改善尿蛋白含量，血清Bun、Scr含量变化，表明白豆蔻挥发油可以促进物质代谢产物的排出，从而改善肾功能障碍[7-8]。有研究表明庆大霉素所致的急性肾损伤可以通过在溶酶体，高尔基体等细胞器的堆积，最终导致细胞出现凋亡，其主要是通过线粒体通路导致细胞凋亡[9-11]。研究结果显示白豆蔻挥发油可以改善肾组织中MDA、SOD、GSH-Px、NO和NOS的改变，表明白豆蔻挥发油对肾组织中ROS的释放有改善作用。ROS的过度释放，可以直接或间接导致细胞出现凋亡，表明白豆蔻可以通过抑制ROS的释放来改善细胞凋亡[12]。另外，白豆蔻挥发油还可以抑制凋亡相关蛋白NF-кB p65、Caspase-3、Bax蛋白的表达，促进Bcl-2蛋白的表达，表明白豆蔻挥发油一方面可以直接通过抑制Bax蛋白的表达、促进Bcl-2蛋白的表达来抑制线粒体释放细胞色素C，从而抑制细胞凋亡，另一方面，还可以通过抑制IкB蛋白裂解导致的NF-кB二聚体解体后进入细胞核所引起的凋亡蛋白基因Bcl-2、Bax的改变来间接抑制细胞凋亡[13]。此外，在模型组大鼠肾组织中可以观察到严重钙化现象，其它各组有所改善，表明白豆蔻挥发油还可以抑制Ca2+内流引起的细胞凋亡[13]。

白豆蔻作为一种传统中药，大量研究发现白豆蔻具有镇咳祛痰平喘、抗炎、促消化等多种作用[14-15]。此外，白豆蔻在治疗肾病方面有广泛的应用，在蒙医和藏医中均有治疗肾病的记载，现代运用中在对慢性肾衰、慢性肾盂肾炎、急慢性肾风、难治性肾病综合征等多种肾病的治疗时也均有白豆蔻的使用记录，表明其在治疗肾病方面具有一定的疗效。白豆蔻的药用部位为干燥成熟果实，其中富含挥发油，挥发油作为一种混合物，其中含有1，8-桉油精(1,8-cineole)、α-蒎烯(α-pinene)、樟脑(camphor)等多种成分[16]，其中1，8-桉油精为其主要成分，由于产地不同1，8-桉油精含量有一定的差异，约在49%～82%之间。有研究表明1，8-桉油精具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、杀虫、镇痛等作用[17-19]。也有研究表明，白豆蔻挥发油具有抗失眠、杀虫、抗氧化等作用[20-22]。现代研究中对白豆蔻挥发油对肾病治疗机制的研究还很少，运用现代研究方法可以逐渐阐明白豆蔻挥发油的作用机制，解释白豆蔻挥发油治疗肾病的科学内涵。本文主要探讨了白豆蔻挥发油在凋亡通路上对庆大霉素所致急性肾损伤的影响，在其它机制作用方面的探究有所欠缺，此外白豆蔻挥发油对其它肾病的作用效果也有待进一步研究。