基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶抑制剂1在大鼠Ⅲ期、Ⅳ期压疮创面组织中的表达及意义

宋美毅，李 贤

（1.河北医科大学，河北050051；2.河北省人民医院）

压疮是长期卧床病人常见的难愈性溃疡之一，此类病人骨隆突处，尤其是骶尾部皮肤和皮下组织长期受压导致局部组织持续性缺血、缺氧，并最终引起局限性破损和坏死[1-2]。难愈性溃疡的形成机制比较复杂，有研究表明，基质金属蛋白酶(MMP)过度分泌及持续性炎症反应是导致压疮胶原纤维过度降解的始动因素[3-4]。还有研究显示压疮的形成与基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1）之间失去平衡有关[5-7]。所以，本研究拟通过动物实验，观察对比大鼠Ⅲ期、Ⅳ期压疮形成时创面组织中MMP-9、TIMP-1 的表达水平及MMP-9/TIMP-1 的比值，明确MMP-9、TIMP-1 表达水平及MMP-9/TIMP-1 比值与压疮发生的关系，并探讨MMP-9、TIMP-1 表达水平及MMP-9/TIMP-1 比值与压疮损伤程度的关系，从分子生物水平探讨压疮发生发展机制，为临床预防和治疗压疮提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料与工具 选取清洁级健康雄性SD 大鼠30 只，购自河北医科大学实验动物中心，体重（200±20）g，合格证编号：1807223；圆形铁片（直径15.0 mm，厚0.3 mm，重0.6 g，高压灭菌消毒）；圆形磁铁（直径15.0 mm，厚5.0 mm，重2.6 g，磁通量高达1 500 高斯，购自上海江翊机电设备有限公司）；MMP-9和TIMP-1 抗体试剂盒（武汉三鹰生物技术有限公司）；显微镜（型号：NIKON Eclipse ci）；切片成像系统（型号：NIKON digital sight DS-FI2）；Image-Pro Plus 图像分析系统；扭力天平（型号：TN 100F）；硫酸纸；卡纸等。

1.2 实验分组 将30 只雄性SD 大鼠在临床医学研究中心动物实验室适应性饲养（饲养温度20～25 ℃,饲养湿度40%～60%）1 周后,根据体重大小按随机数字表法随机分为Ⅲ期压疮组和Ⅳ期压疮组，每组15只，体重比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

1.3 建立大鼠Ⅲ期、Ⅳ期压疮模型 根据缺血再灌注损伤原理，参照Peirce 等[8-9]埋置铁片加外用磁铁加压的造模方法，制作大鼠压疮模型。大鼠禁食禁水8 h 后称重，按50 mg/kg的剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，在大鼠背部正中线左侧臀部备皮，范围为4 cm×4 cm，用5%聚维酮碘消毒后，切1 个2 cm 的切口，用镊子钝性分离筋膜和组织至露出肌肉，将高压灭菌后的铁片置于肌肉下，用4-0 DeXon 聚羟基乙酸线单纯间断缝合切口，再用5%聚维酮碘消毒缝合处以防感染。16～20 h 恢复期过后，大鼠接受缺血再灌注造模，即在大鼠臀部体外放置磁铁对局部皮肤、肌肉等组织产生压力，加压2 h 后取下磁铁，恢复血流半小时再重复以上循环，每天进行5 个循环，第2 天重复进行。Ⅲ期、Ⅳ期压疮模型判断标准参考黄倩[10]的研究：大鼠受压处全层伤口失去全层皮肤组织，除了骨、肌腱或肌肉尚未暴露外，可见皮下组织，提示Ⅲ期压疮造模成功；大鼠受压处全层伤口失去全层皮肤组织，损伤深达肌肉组织，露出铁片，提示Ⅳ期压疮造模成功。

1.4 观测指标和方法

1.4.1 压疮形成时的创面面积 在大鼠Ⅲ期、Ⅳ期压疮形成当天，分别从两组中随机抓取3 只大鼠。参考张亚楠等[11]的卡纸法测量压疮创面面积：从质地均匀的卡纸上剪下3 个不同位置的2 cm×2 cm 的正方形纸片，称重后计算出每平方厘米的卡纸重量，再用透明尿酸纸拓出大鼠创面大小后，将透明尿酸纸放到同一卡纸上，画出创面范围后沿边缘剪下称重，精确到0.000 1 g。最后用画有创面大小的卡纸重量除以该卡纸每平方厘米的重量，即可得出大鼠压疮创面面积。

1.4.2 病理学改变和MMP-9、TIMP-1 表达水平 在大鼠Ⅲ期、Ⅳ期压疮形成后，从两组中分别随机抓取3只大鼠剖取压疮部位组织，经4%多聚甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋，制成4 μm 厚的切片，用于病理和免疫组化染色。①病理学结果：切片经HE 染色后在光学显微镜下观察病理学改变。②MMP-9、TIMP-1 表达水平：切片经免疫组化染色（一抗用1∶200 的比例进行稀释）后分别在100 倍、400 倍光镜下观察。阳性表达为组织切片中细胞胞浆呈现为淡黄色至棕褐色。在400倍光镜下每张切片随机取5 个视野，用Image-Pro Plus图像分析软件，选择合适的灰度分割阈值，测定切片阳性反应物的累积光密度值（IOD 值）及面积（AREA），并求出平均光密度值（AO 值）作为MMP-9、TIMP-1的相对表达量。

1.5 统计学方法 应用Excel 和SPSS 23.0 软件进行数据录入和统计分析,符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示。两组大鼠压疮形成当天的创面面积及MMP-9、TIMP-1 表达量比较均进行两独立样本t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠Ⅲ期、Ⅳ期压疮形成当天创面面积比较 Ⅲ期压疮的创面面积在压疮形成当天为（1.71±0.41）cm2，明显小于Ⅳ期压疮（3.08±0.88）cm2，差异有统计学意义（t=-5.434，P＜0.001）。

2.2 大鼠Ⅲ期、Ⅳ期压疮创面的病理改变 大体观察大鼠Ⅲ期压疮创面可见表皮层大面积坏死脱落，核固缩深染，胞质嗜酸性增强，真皮层大面积坏死溶解，并可见少量炎性细胞浸润；局部可见大量出血；未见毛囊、皮脂腺等附属器官。两组大鼠创面组织病理学改变详见图1。Ⅳ期压疮创面病理学改变较Ⅲ期压疮加重，局部可见大面积肌纤维坏死，坏死肌纤维淡染，肌原纤维排列疏松，周围可见较多的炎性细胞浸润，大面积的肌纤维坏死溶解，溶解后被增生的结缔组织取代，增生的结缔组织中也可见弥漫性淋巴细胞以及单核细胞浸润。由图1 可见两组压疮创面组织均发生病理学改变，但Ⅳ期压疮创面病理损伤程度更严重。

图1 大鼠Ⅲ、Ⅳ期压疮创面组织病理学观察（苏木精-伊红×100）

2.3 大鼠Ⅲ期、Ⅳ期压疮组织中MMP-9、TIMP-1 的表达水平及MMP-9/TIMP-1 比值 Ⅲ期压疮组织中MMP-9 的蛋白表达量为（21.17±1.34），Ⅳ期压疮组织中MMP-9 的蛋白表达量为（31.62±2.98），Ⅳ期压疮组织中MMP-9 的蛋白表达量明显高于Ⅲ期压疮组织中的表达量，差异有统计学意义（P＜0.05）。

Ⅲ期压疮组织中TIMP-1 的蛋白表达量为（52.66±3.71），Ⅳ期压疮组织中TIMP-1 的蛋白表达量为（49.86±1.38），TIMP-1 在大鼠Ⅲ期、Ⅳ期压疮组织中的蛋白表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。Ⅳ期压疮组织中MMP-9/TIMP-1 比值为（0.64±0.07），明显高于Ⅲ期压疮组织中的比值（0.40±0.01），差异有统计学意义（P＜0.05）。大鼠Ⅲ期、Ⅳ期压疮组织MMP-9、TIMP-1 及MMP-9/TIMP-1 比较结果见表1。

表1 Ⅲ期、Ⅳ期压疮组织中MMP-9、TIMP-1 蛋白表达量及MMP-9/TIMP-1 比较(±s)

表1 Ⅲ期、Ⅳ期压疮组织中MMP-9、TIMP-1 蛋白表达量及MMP-9/TIMP-1 比较(±s)

组别Ⅲ期压疮组Ⅳ期压疮组t 值P MMP-9 21.17±1.34 31.62±2.98-5.536 0.005 TIMP-1 52.66±3.71 49.86±1.38 1.228 0.287 MMP-9/TIMP-1 0.40±0.01 0.64±0.07-5.623 0.005

2.4 大鼠Ⅲ期、Ⅳ期压疮创面组织MMP-9、TIMP-1 免疫组化染色表达情况（见图2、见图3）

图2 大鼠Ⅲ期、Ⅳ期压疮创面组织MMP-9 免疫组化染色（二氨基联苯胺-苏木精×100）

图3 大鼠Ⅲ期、Ⅳ期压疮创面组织TIMP-1 免疫组化染色（二氨基联苯胺-苏木精×100）

3 讨论

3.1 大鼠Ⅲ期、Ⅳ期压疮创面面积及病理学比较 本研究结果显示，Ⅳ期压疮创面的病理损伤程度明显重于Ⅲ期压疮，且Ⅳ期压疮创面面积大于Ⅲ期压疮，说明随着压疮分期的进展，组织病理损伤越重，创面面积越大，压疮向不可逆损伤发展，越不易愈合。

3.2 MMP-9、TIMP-1 在Ⅲ期、Ⅳ期压疮组织中的表达及在压疮发生过程中的作用机制

3.2.1 MMP-9 在Ⅲ期、Ⅳ期压疮组织中的表达及在压疮发生过程中的作用机制 MMPs 是一种锌依赖性内肽酶，在中性pH 状态下降解几乎所有的细胞外基质和基底膜蛋白[12]，其中MMP-9 分子量最大，在细胞中普遍存在，比如巨噬细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞、中性粒细胞等[13]。MMP-9 具有降解细胞外基质的作用[14]，而细胞外基质在正常组织的重塑、修复以及病理生理的过程中发挥重要作用[13]。本研究结果显示，Ⅳ期压疮组织中MMP-9 的表达水平明显高于Ⅲ期压疮，说明随着压疮严重程度的加深，MMP-9 的含量也随之升高，提示MMP-9 表达越高，越不利于创面愈合，甚至会导致压疮进一步向不可逆方向进展。时红梅等[13]的研究同样显示，压疮病人的创面越严重，MMP-9 的含量就越高，创口就更难愈合，与本研究结果及结论一致。由此推测，MMP-9 在压疮发生过程中发挥重要机制，组织中MMP-9 的表达越高，提示发生压疮损伤程度越重。

3.2.2 TIMP-1 在Ⅲ期、Ⅳ期压疮组织中的表达及在压疮发生过程中的作用机制 TIMPs 具有抑制MMPs 活性、刺激细胞分裂、结合细胞外基质、抑制血管形成、诱导细胞凋亡的生物功能[13]。TIMP-1 是TIMPs 家族中的一种可溶性糖蛋白，主要由巨噬细胞和结缔组织细胞分泌，在体内分布广泛，与MMP-9 的催化区以1∶1 可逆性结合，抑制MMP-9 的活性[15]。本研究结果显示，TIMP-1 在Ⅳ期压疮组织中表达水平为（49.86±1.38），较 低 于Ⅲ期 压 疮 组 织（52.66±3.71），但差异无统计学意义。两组大鼠创面组织中TIMP-1 均处于较低水平，说明随着压疮严重程度的加深，MMP-9 的表达上调，没有足够的TIMP-1 来结合高水平的MMP-9，导致组织中基质过度分解，皮肤组织结构的完整性受到破坏，内环境稳态被打破，从而使压疮向更深程度发展。

3.2.3 MMP-9/TIMP-1 比值在Ⅲ期、Ⅳ期压疮组织中的表达及在压疮发生过程中的作用机制 在生理状态下MMP-9 与TIMP-1 之间保持着动态平衡，协调细胞外基质降解与重建，维持组织结构的完整和内环境的稳定，当MMP-9/TIMP-1 的比值越高，组织出现过度降解的程度越重[16]。在本研究中，MMP-9/TIMP-1 比值在Ⅳ期压疮组织中明显高于Ⅲ期压疮，说明压疮损伤程度越重，MMP-9/TIMP-1 比值越高。MMP-9 长期处于高表达的状态，TIMP-1 表达缺乏，使MMP-9/TIMP-1 比值失衡，会引起局部受压组织中的胶原、弹性蛋白等细胞外基质成分发生大量降解，皮肤、肌肉组织抵抗能力下降，进而造成压疮的发生发展。张亚楠等[17]的研究同样发现MMP-9/TIMP-1 的比例失衡是促进压疮发生发展的重要因素。

3.3 MMP-9/TIMP-l 有望成为治疗压力性溃疡的新靶点 本研究结果发现，随着压疮组织损伤程度加深，组织中MMP-9 表达上调、MMP-9/TIMP-1 比值增高，而TIMP-1 表达水平几乎没有发生变化，临床中是否可通过外用TIMP-1 来重新使MMP-9/TIMP-1 处于平衡状态，阻止压疮组织中MMP-9 的水平过高而阻碍细胞外基质降解，阻止细胞凋亡发生，从而逆转压疮组织不可逆损伤，阻止压疮向更深程度的发展，促进早期压疮的愈合。王越等[15]的研究同样发现，渗出液中过高的MMP-9 表达水平及MMP-9/TIMP-1 比值不利于压疮的愈合，并且提出将MMP-9 表达水平及MMP-9/TIMP-1 比值作为预测创面愈合的一个评估指标。所以，在下一步的研究中，应积极探索MMP-9/TIMP-l 比值作为治疗压疮新靶点的临床实用价值。

4 小结

综上所述，MMP-9 表达水平和MMP-9/TIMP-1比值在大鼠Ⅳ期压疮组织中表达明显高于Ⅲ期压疮，说明随着压疮损伤程度的加重和压疮分期的提高，MMP-9 的表达水平和MMP-9/TIMP-1 比值也随之提高。MMP-9 和MMP-9/TIMP-1 比值与压疮损伤程度及分期有关，MMP 及其抑制剂的代谢平衡在压疮发生机制及损伤分期中起重要作用，调整MMP-9/TIMP-l比值有望成为治疗压力性溃疡的新靶点。