智能识别鉴定M蛋白分型

王仁浩，谢 婧，管仲斌，谢松业△

(1.上海兰卫医学检验所股份有限公司医学检验科，上海 200335；2.澳大利亚阿德莱德大学，澳大利亚南澳大利亚州阿德莱德 5005)

M蛋白分型种类多,诊断方法除流式细胞外[1-2]，血清蛋白电泳及免疫学方法已成为确诊M蛋白血症的重要手段[3-4],其中血清免疫固定电泳对多发性骨髓癌(MM)患者血清中的单克隆免疫球蛋白(Ig)进行分型鉴定具有高特异性和高灵敏性[5]。虽然免疫固定电泳图谱简单,但在目前临床医学检验中对M蛋白的分型、判断、识别均是通过人工肉眼观察，易产生主观判断误差及漏判。本文釆用计算机智能鉴定免疫固定电泳M蛋白成分主要的思考方法是先找到M蛋白带，再根据其他5个不同组分的图像信息进行综合匹配处理。根据健康人的免疫固定电泳6组的一维数据的峰高与峰宽的阈值范围来判断患者血清免疫固定电泳某组分峰值特征是否有意义，即患有M蛋白血症。最后，鉴别出不同类型的M蛋白，并给出结果。这样大大提高了M蛋白血症的筛查效率，减少了人为误差,为临床诊治和预后提供了科学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 标本采集：15例免疫固定电泳(书)示范图片[6]，35例M蛋白血症标本中包括20例不同类型M蛋白血症患者和15例健康人。标本由上海交通大学附属第一人民医院实验室提供。

1.2仪器与试剂 (1)试剂：美国Helena公司提供，试剂批号：3415和3416和3417；(2)仪器设备：全自动快速电泳分析仪由美国Helena公司提供，为SPIFE 3000型或SPIFE4000型；(3)参数设置和操作步骤：详见REP电泳仪操作规程；(4)扫描仪：Canon KEW36823。

1.3方法

1.3.1免疫固定电泳测定 方法学原理：免疫固定电泳将血清或其他标本在琼脂(醋酸纤维素)平板上做区带电泳，然后在其上加入已知相应单价抗血清，当抗体与其区带中的单克隆Ig结合后，便形成抗原抗体复合物沉淀(固定)下来。通过漂洗和染色，呈现浓而狭窄的着色区带，即可判断单克隆Ig的轻链和重链类型。一般免疫固定电泳鉴定M蛋白成分主要由6个组分组成:(1)蛋白电泳;(2)IgG;(3)IgA;(4)IgM;(5)免疫球蛋白κ链;(6)免疫球蛋白λ链。第1组分为总的血清蛋白成分，第2～4组分为“重链”(其实免疫球蛋白是由2条重链和2条轻链组成)，第5～6组分为轻链，共由6个组分的电泳带组成。健康人免疫固定电泳中的蛋白电泳只出现清蛋白等5种蛋白成分，不出现M蛋白成分区带,且IgG、IgA、IgM及κ链和λ链电泳带颜色较浅，扫描后一般峰宽大于峰高。采用不同的颜色把3幅峰形电泳图合并为一张电泳图，便于直观显示给医生，为诊断疾病提供合理的依据。

1.3.2设计思路 首先，把6幅图像经过扫描转换成数据信息。其次，将二维数据转换成一维数据，为了便于智能化鉴定M蛋白成分，采用不同的颜色把6幅电泳图数据信息绘制成一张电泳图，先在其中血清蛋白电泳中找到M蛋白带，再根据其他5个不同组分的图像信息进行综合匹配处理。为了便于参数传递，根据健康人的免疫固定电泳6组的一维数据的峰高与峰宽阈值范围来判断患者血清免疫固定电泳某组分峰值特征是否有意义，即是否患有M蛋白血症。最后鉴别出不同类型的M蛋白，并给出结果。免疫固定电泳智能化鉴定M蛋白成分的电泳流程见图1。智能化鉴定免疫固定电泳M蛋白成分电泳特点，(1)正常：若蛋白电泳没有找到M蛋白带,而且重链和轻链峰值特征全部无意义输出正常；(2)正常？建议复做:仅仅蛋白电泳峰值有意义其余峰值无意义输出“正常？建议复做”;(3)游离κ、λ型轻链病:若蛋白电泳出现M蛋白,重链峰值特征无意义且κ和λ型轻链同时有特征性意义时输出游离κ、λ型轻链病;(4)游离κ型合并κ型IgA单克隆免疫球蛋白病:当κ或λ有2个有意义峰值a和b时，若IgA有一个有意义的峰值c，a与c横坐标相同，b与c坐标不同，则输出游离κ型合并κ型IgA单克隆免疫球蛋白病;(5)游离κ型轻链病:若κ或λ有特征意义峰值，并且重链峰值全部无特征意义，则输出“游离κ型轻链病”;(6)κ型IgA单克隆免疫球蛋白病:若蛋白电泳出现M蛋白带,κ或λ峰值有价值，同时存在有价值的IgA或IgM或IgG，并且前一组峰值横坐标与后一组峰值横坐标相符，则输出κ型IgA单克隆免疫球蛋白病;(7)κ型IgA单克隆免疫球蛋白病(？):若蛋白电泳出现M蛋白带,κ或λ有价值峰值，同时存在有价值的IgA或IgM或IgG,但前一组峰值横坐标与后一组峰值横坐标不相符，则输出κ型IgA单克隆免疫球蛋白病(？);(8)多克隆病:κ或λ有价值，同时IgA或IgM或IgG为有价值宽峰(波高>100同时波宽>波高)，其中峰值“有意义”指峰高大于峰宽4∶1。重链指IgG、IgA、IgM，轻链指κ型、λ型。

1.3.3实验过程 (1)利用按键精灵电脑软件把50幅免疫固定电泳图片按图中不同深浅的蓝色条带转化为数据信息，再将二维数据转化为一维数据。根据M蛋白与蛋白电泳对应的位置、区带深浅、宽窄的不同即峰值数据的位置和大小及左右峰谷的长度，确立峰高度与峰宽度的比例范围,血清M蛋白在蛋白电泳中可在α2至γ区形成浓度高的区带,扫描图中可见基底较窄,高而尖锐的峰,在γ区蛋白峰高大于峰宽，在β区和α2区也是如此,以此参数来判断M蛋白的真伪,大大减少了肉眼判断的误差，见图2。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析处理。智能和传统两种方法鉴定M蛋白成分的差异采用χ2检验进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

图1 智能化鉴定M蛋白带流程图

注：基线与IgM重合。

2 结 果

2.1把图片生成的数据用自编软件的程序转化为直观的一个峰值图谱，储存在Excel文档中。

2.2按免疫固定电泳的区带位置染色的深浅和峰高与峰宽的比例关系，采用计算机语言编程，智能化鉴定免疫固定电泳M蛋白成分，最后鉴别出不同类型的M蛋白，并做出结果。

2.2.1采用免疫固定电泳法用SPIFE3000或4000型全自动电泳仪获得血清标本的6张凝胶电泳图。

2.2.2扫描6张电泳图片，输入计算机。

2.2.3用按键精灵软件，将6张电泳图片扫描转换成一维数据储存在Excel文档里。

2.2.4用自编软件打开步骤C获得的Excel文档数据，软件可以从中获得免疫固定电泳中蛋白电泳(DY)、IgG、IgA、IgM、κ型、λ型数据。获得各条线的参数，包括：峰值坐标、左波谷坐标、右波谷坐标、波宽是否大于波高峰值、各线峰值；然后根据患者蛋白电泳中ɑ至λ区域的峰值与标准峰值(健康人)同区域的数据比较大小。如果患者输出的峰值比标准峰值大,则这条线的峰还要进一步判断是否有价值,也就是根据左波谷坐标至右波谷坐标的峰宽是否大于峰高,如果峰高大于峰宽,判断为有价值(含M蛋白带),然后进一步按流程鉴定为哪一类型的M蛋白。

2.2.5输出鉴别结果 根据判断M蛋白带的理论依据寻找属于哪一类单克隆免疫球蛋白病,并打印报告，包括κ和λ链的比值。κ和λ链的比值在采用传统免疫固定电泳方法肉眼判断时是无法辨别的,因为肉眼不能判断颜色的深浅确切值,而软件采取的是按键精灵的捕色软件,它可以测出κ和λ链的颜色深浅具体值,然而κ和λ链的比值在诊断多发性骨髓瘤是很有价值的。这个结果和免疫散射比浊法测定κ和λ链的比值具有良好相关性(n=38，r=0.889),经统计κ和λ链比值,健康人参考值为1.16±0.2(n=32)，所有M蛋白血症患者中κ型患者κ和λ的比值明显大于1.36，而λ型患者κ和λ的比值明显小于0.96,这个软件可以同时测定κ和λ链，减少了患者再次测定κ和λ链所带来的麻烦。

本文提供一种利用鉴定免疫固定电泳M蛋白成分的系统，该系统包括以下设备：A步骤的设备为SPIFE3000或4000型全自动电泳仪，获得血清标本的6张凝胶电泳图;B步骤的设备为扫描仪：Canon KEW36823,扫描6张电泳图片，输入计算机;C步骤的设备为计算机用按键精灵软件，将6张电泳图片扫描转换成一维数据储存在Excel文档中;D步骤的设备为自编软件安装计算机，它可以直接打开步骤C获得的Excel文档数据,然后进一步按流程鉴定为哪一种类型的M蛋白并输出鉴别结果及图像。见图3～5。

图3 κ型IgM单克隆免疫球蛋白病

2.3实验的临床应用 由作者和临床免疫专家[6]选出50幅免疫固定电泳图像包含血清蛋白电泳图像。选择原则是既满足于常规检查的M蛋白类型，又包括很少见的类型和书图谱上的特例图像，经扫描成图片后，用按键精灵电脑软件把图片转化为数据。采用计算机编程智能化鉴定免疫固定电泳M蛋白成分，通过对50幅免疫固定电泳图像和血清蛋白电泳图像的数据分析，评价自动扫描、鉴定的整体性能。

图4 游离λ型单克隆免疫球蛋白病

图5 κ、λ型IgG单克隆免疫球蛋白病

2.3.1实验结果分析 采用联想电脑M7150，CPU256M内存，完成资料标本50幅扫描、分析及鉴定，M蛋白区带35，正确识别33(94.3%)，其中M蛋白IgG区带κ型10,正确识别10(100%),λ型5,正确识别5(100%),κ、λ混合型2,正确识别2(100%)；M蛋白IgA区带κ型3,正确识别3(100%),λ型+游离λ型1,正确识别1(100%)；M蛋白IgM区带κ型3,正确识别3(100%),λ型1,正确识别1(100%),κ、λ混合型1,正确识别1(100%),混合型λ型IgM + κ型IgG 1,正确识别1(100%),游离κ区带1,正确识别1(100%),游离λ区带7,正确识别7(100%)。正常人区带15,正确识别15(100%)。

2.3.2性能验证 智能和传统两种方法鉴定M蛋白成分差异无统计学意义(P>0.05)。智能化鉴定M蛋白成分方法的正确度为96.0%，灵敏度为94.3%，特异度为100.0%，假阴性率(漏诊率)为4.0%，假阳性率(误诊率)为0.0%,阴性似然比为6，Kappa值为0.908，阳性预测值为100.0%，阴性预测值为88.0%。

3 讨 论

M蛋白血症是一种浆细胞异常增生的恶性肿瘤，浸润骨髓和软组织产生M球蛋白及多肽，引起骨骼破坏、肾脏病变和贫血,但该病起病缓慢，无症状期长短不定,短至几个月长达十余年，由于症状多样化及个体差异，出现的临床表现繁多和复杂，初发病常常不被发现而多被误诊。亚州人MM发病率为0.5/100 000～1.0/100 000[7]，70岁以上的老年人发生率为3%，通过骨髓涂片、组织活检、X线片来诊断外,其他血清蛋白电泳及免疫学方法已成为确诊MM的重要手段，其中血清免疫固定电泳是对MM患者血清中的单克隆免疫球蛋白进行分型鉴定，具有高特异度和高灵敏度，也可以识别M蛋白双克隆[8]。目前缺乏标准化鉴别分型方法,临床医学检验中对M蛋白的分型、判断、识别都是人工肉眼观察，易产生主观判断误差及漏判。应用计算机模式识别技术,能做到与医学检验专家一样，智能快速、准确地识别细胞[9]和DNA凝胶电泳分子量测量[10]，但未见智能鉴定M蛋白的成分。本系统应用电脑扫描模式识别技术，采用可对血清蛋白电泳和免疫固定电泳图谱实现自动识别、分类、综合分析给出正确鉴别结果,该方法可以同时计算出κ和λ链,因为肉眼不能判断颜色的确切深浅值，然而κ和λ链的比值诊断MM是很有价值的[11-12]。这个软件可以同时测定κ和λ链比值,减少了患者再次测定κ和λ链所带来的麻烦。通过对50幅免疫固定电泳图像的数据分析，虽然合并游离轻链判断有漏检,但评价自动扫描整体性能的鉴定及临床应用准确度达96%,Kappa值达0.908，与传统方法比较差异无统计学意义(P>0.05)。

4 结 论

计算机能做到与医学检验专家一样，智能快速、准确地识别M蛋白的成分，并鉴定出是哪一种类型的M蛋白病,提高了检查效率，减少了人为误差，给临床实验室带来了极大的方便，也为临床医生鉴別诊治和预后提供了科学依据。