噬菌体应用于污水处理过程的探讨

熊文斌,卢 晗,刘新春

(中国科学院大学资源与环境学院，北京 101408)

随着科技进步与社会发展，人们开始越来越重视水环境的安全问题。在污水处理过程中，现存工艺存在着诸如污泥膨胀等系统运行不稳定问题，影响污水处理效果，并存在病原菌排入环境的安全隐患。

噬菌体是一种有效的抗菌剂，在欧洲一些国家以及前苏联地区曾一度试行过用噬菌体疗法来治疗疾病。后来由于抗生素的发现与使用，噬菌体疗法逐渐被人们淡忘。由于耐药菌的不断出现，加之新型抗生素研发周期过长，抗生素疗法遭遇瓶颈。鉴于此，噬菌体治疗再次引起了人们的重视。同时，基因测序技术以及分子生物学的高速发展也为噬菌体技术的应用提供了有利的条件[1-2]。目前，噬菌体已经在医学[3]、渔业[4]、食品行业[5]等领域开展了相关应用，主要是筛选一些烈性噬菌体，利用其专一性裂解目标细菌这一特性来杀灭一些特定的病原菌。

与噬菌体治疗在医学上的应用类似，噬菌体介导的生物防治技术作为一种经济手段在缓解饮用水、废水及其他环境问题方面具有良好的应用前景，是污水处理过程中治理污泥丝状膨胀、消毒、监测水体等的一个全新的研究方向。为此，本文对噬菌体在污水处理过程中的应用进行了探讨，为进一步扩大噬菌体技术的实践应用提供理论指导。

1 噬菌体的生理特性

图2 噬菌体在污水处理过程中的应用Fig.2 Application of Phage in Wastewater Treatment

噬菌体是世界上数量最丰富的微生物，水生系统中噬菌体的数量在每毫升104～108[6]。噬菌体是能够感染细菌、真菌、藻类、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体[7]。它不具有完整的细胞结构，其单一核酸由蛋白质外壳所包围。噬菌体普遍由棱柱形头部内的遗传物质(被蛋白质衣壳、尖刺和附着于细菌的尾巴纤维包围)和中空管(尾鞘)这两部分组成，其遗传物质从该中空管注入宿主中[8]。噬菌体的特异性取决于其自身的尾纤维蛋白以及细菌细胞表面的特异性受体[9]。

根据噬菌体感染宿主后的生理行为可以将噬菌体大致分为两类：烈性噬菌体与温和噬菌体。前者将遗传物质注入宿主细胞后进行自我复制并表达，在宿主细胞内组装成子代病毒颗粒，最终使细胞裂解，释放出子代噬菌体(图1)。温和噬菌体的遗传物质则在进入宿主细胞后与细菌基因组相整合，成为原噬菌体。在一定外界条件刺激下，原噬菌体也会进入裂解循环。

图1 噬菌体的裂解周期Fig.1 Lytic Cycle of Phage

噬菌体常常具有严格的宿主范围，其原因在于噬菌体的细胞受体具有严格的种系特异性。例如，T2和T6噬菌体的细胞受体是大肠杆菌细胞外壁层的脂蛋白，而T3和T5噬菌体的细胞受体是细胞壁中层的脂多糖[10]。因此，在一般情况下，噬菌体只会感染特定的宿主细菌，而不会感染真核细胞生物。

噬菌体复制速度非常快。据报道，一个单位的烈性噬菌体感染一个细菌后，只需重复 4 个感染周期，即可杀灭 10 亿个细胞[11]。

2 噬菌体在污水处理过程中的应用

受噬菌体在医学、食品等领域用于处理致病性细菌感染的启发，研究者们认为噬菌体作为选择性、自我复制的细菌控制剂在水和废水处理领域同样具有应用潜力，能够在传统工艺的许多环节中发挥其独特作用(图2)。

2.1 活性污泥丝状膨胀的治理

在活性污泥系统运行不正常的情况下，活性污泥会发生膨胀。活性污泥膨胀分为丝状膨胀和非丝状膨胀两种情况。据报道，约有90%的污泥膨胀为丝状细菌过度生长而导致的丝状膨胀[12]。丝状细菌在适宜的环境条件下过度生长，导致活性污泥非正常膨胀。片状絮凝物变为丝状(直径<10 mm)，絮凝物体积减小，污泥沉降性能变差，出水水质严重恶化。

传统的药剂如灭菌剂、絮凝剂等仅能暂时控制污泥膨胀，一旦停止投加，很有可能再次发生污泥膨胀。此外，药剂的投加还有可能对活性污泥中的其他微生物产生不良影响。由此，研究人员提出利用噬菌体作为丝状菌的专性灭菌剂来控制污泥膨胀，认为噬菌体能够快速侵染宿主并进入裂解循环，从而达到迅速消灭过度繁殖的丝状菌的目的。同时，噬菌体具有专一性，不会侵染污泥体系内的其他微生物，对系统的生态稳定性不会造成影响。

目前，已经分离出可以裂解红球菌属(Rhodococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)以及戈登氏菌属(Gordonia)等[13-16]能够引起污泥膨胀和生物发泡的诺卡氏型丝状细菌的烈性噬菌体。此外，Petrovski等[17]分离出能够裂解雅氏四联球状菌(Tetrasphaerajenkinsii)丝状细菌的烈性噬菌体。Dyson等[18]发现，在污泥体系中，83%的诺卡氏型丝状菌的基因组中疑似携带温和噬菌体序列。通过丝裂霉素C外源物的诱导，能够使整合在丝状菌基因组中的原噬菌体进入裂解循环，进行复制与表达噬菌体蛋白质，形成子代噬菌体并裂解细胞。Choi等[19]分离出能够专性裂解浮游球衣菌(Sphaerotilusnatans)的烈性噬菌体。通过实验室模拟装置，检验其治理由Sphaerotilusnatans引起的丝状膨胀的效果，仅在数小时后，污泥体积显著减小，出水水质得到改善。研究人员发现[20]，噬菌体能在短时间内快速侵染并裂解宿主菌，使污泥沉降能力迅速上升。在投加噬菌体后，丝状细菌的数量快速下降。经分析发现，原本丝状絮凝物直径开始逐渐变大，即污泥体系中的絮凝体尺寸在丝状菌数量减少后增大，污泥沉降性能得到改善，上清液更清澈。表明，丝状菌死亡减轻了丝状菌对絮凝过程的扰动影响，从而使絮凝过程更加稳定。同时，检测发现，噬菌体应用过程中，污泥体系中COD和氨氮的去除效率无明显下降。由此说明，噬菌体对活性污泥工艺的正常功能暂无显著负面影响。当然，目前噬菌体的应用仍局限于实验室阶段，尚无实际应用案例。噬菌体在实际工程中治理污泥膨胀的效能有待进一步实践探索。

2.2 消毒

近年来，由水体污染带来的水媒型传染病的暴发时有发生。据统计，每年因水媒型传染病造成的死亡人数约占全世界总死亡人数的4%。当前污水处理工艺中主要的消毒工艺是液氯消毒，虽然能够去除水中大部分的病原菌，但总有残留，且存在费用高、易产生三氯甲烷等消毒副产物的缺陷[21]。在一些经济水平不够发达的国家和地区，水处理技术并不达标，经污水厂排放的处理水中往往存在超标数量的致病菌[22]。

噬菌体在医学领域上的应用表明其是一种具有优秀抗菌潜力的抗菌剂，能够特异性地杀灭目标病原菌而不对环境中其他生物造成不良影响。水生环境中，对噬菌体引起的细菌死亡率的估计表明，噬菌体可导致1%～100%的细菌死亡率，这取决于水体环境的营养状态(表1)[23]。在二级出水消毒环节，可通过直接利用噬菌体特异性地裂解目标菌株及生物膜，或利用噬菌体形成的选择压力来选择生长较慢、更易受杀菌剂或竞争性排斥的噬菌体抗性细菌，来降低目标种群对环境的适应度[24]，以尽量减少出水中耐药性致病菌的数量，削弱耐药性致病菌进入环境后带来的健康风险。

表1 不同水生环境中噬菌体致细菌死亡占细菌死亡率的比率Tab.1 Ratio of Bacteria Fatality by Phage to Total Bacterial Death in Different Aquatic Environments

Beheshti等[22]从河水中分离鉴定了两株对大肠杆菌PTCC1 399株和大肠杆菌SBSWF27株及当地污水中大肠菌群有裂解作用的噬菌体。以大肠杆菌噬菌体混合物(phage cocktail)处理城市污水，培养2 h后，大肠菌群的最大或然数(MPN)下降了22倍。Dhevagi等[25]分离出的广谱噬菌体能够裂解大肠杆菌多种菌株，致力于处理医院废水中的耐药性细菌。此外，一些研究人员尝试从水样中分离出了能够针对其他致病菌的噬菌体。张仲阳等[26]与Leuschner等[27]分别从水样中分离出针对鼠伤寒沙门氏菌噬菌体Pst87170与PWH2，均证明其对鼠伤寒沙门噬菌有良好的消灭效果，且具有不错的热稳定性与酸碱耐受性，具有应用潜力。根据现有的一些关于噬菌体“鸡尾酒疗法”的研究，可以通过构建新型噬菌体制剂对污水进行消毒。噬菌体不仅具有高效而专一的杀菌效果，且复制速度极快[11]，在污水中存活时间长，拥有类似余氯的持续消毒效果。

同时，在人类使用噬菌体的过程中并没有出现明显的感染症状[5]。它们仅对具有对应细胞受体的宿主细菌产生感染现象，于人类以及哺乳动物而言暂无显著负面影响。但是，由于噬菌体对环境条件较为敏感，且基因频繁地水平转移，宿主菌或将由此获得抗生素抗性基因，加剧抗生素治疗失效问题。这一现象需要引起相关研究人员的关注。

2.3 监测水体

污水成分复杂，有机物含量高，十分适合各种微生物(包括各种病原菌)的生长。一旦病原菌在适宜的条件下突然暴发，肉眼或一般的检测仪器无法及时发现，就有可能因为没有及时采取强化消毒措施而导致疫情的暴发。此外，经物理或化学过程消毒后，一些受损但未死亡的细菌细胞可能会在一定条件下休眠一段时间，进行损伤修复或进入非可培养(VBNC)状态，并保持致病性[28]。

噬菌体作为传感器检测细菌已经在食品[29-31]等领域有所应用(表2)。噬菌体与宿主细菌细胞具有亲和力，可作为电化学传感器的识别元件，还可通过检测噬菌体裂解细胞后细胞释放的内容物(如酶和离子等)来检测细菌。Ben等[32]发现噬菌体对感染性的反应能力及其扩增程度与宿主细胞的活性呈正相关，认为可通过噬菌体感染数据来间接反映水中某些致病菌的存活状态与数量。噬菌体在宿主表面的成功吸附依赖于噬菌体的尾受体结合蛋白(receptor binding proteins，RBPs)和宿主表面的特异性受体。Xu等[33]通过试验证明了，具有物种特异性的尾部纤维蛋白对于鉴定宿主具有良好的特异性。利用这一特性，Sedki等[34]提出了一种早期检测大肠菌群的噬菌体电化学阻抗谱细胞传感器：以3-巯基丙酸为连接剂，通过共价键将噬菌体固定在金纳米粒子(AuNPs)表面。大肠杆菌与细胞传感器表面的M13噬菌体结合，增加了电荷转移电阻，从而可检测大肠菌群。该生物传感器非常灵敏，检测限(limit of detection，LOD)为14 CFU/mL，且对大肠菌群表现出高选择性。相较于传统的细胞计数法、显微镜检查等，更加方便快捷，也比PCR、ELISA等技术更加经济。不仅如此，尾部蛋白的特性还为拓宽噬菌体宿主范围提供了新的思路[35]。

表2 基于噬菌体构建的传感器的原理与检测限Tab.2 Principle and Detection Limit of Phage Based Sensor

此外，一些试验证明，噬菌体还可用于检测某些特定病毒或毒素在污水中的浓度。Xu等[36]利用天然羊驼噬菌体展示纳米文库的巨大多样性和容量，通过生物扫描筛选出高活性的微囊藻毒素(MC-LR)纳米体，通过基因克隆在大肠杆菌BL21中表达阳性MC-LR纳米体蛋白，并建立MC-LR的IC-ELISA检测方法，具有灵敏度高、准确性好等特点。

3 噬菌体应用的局限性

研究者们对噬菌体在污水处理方面的应用潜力做出了诸多构想与尝试。尽管有医学、农业等领域应用噬菌体的经验，但要真正实现噬菌体在污水处理领域的广泛应用，仍有一些局限需要突破。主要分为3个部分：噬菌体过于窄的宿主谱、可能携带有毒性或耐药性基因、细菌可能会产生对噬菌体的抗性(表3)。

表3 噬菌体应用的局限性Tab.3 Limitations of Phage Application

3.1 宿主范围

噬菌体特殊的宿主范围使其能选择性解决医疗、污水处理等领域的问题，但同时也使噬菌体治理污水存在一定局限。

噬菌体吸附于宿主细胞并注射遗传物质的过程非常严格，受限于特殊的细胞受体与自身的病毒吸附蛋白[37]。因此，噬菌体的宿主范围十分有限。面对污水处理系统中复杂的细菌组成，很难找到一种或几种噬菌体能够覆盖全部的目标细菌。同时，由于我们对噬菌体与宿主之间的吸附作用了解过少，噬菌体制剂的研发难度大大增加。

研究者们提出建立“噬菌体银行”以及“噬菌体鸡尾酒银行”，即将已知的噬菌体及其相关敏感宿主进行数据分类并构建检索工具，在发现致病菌后可以迅速找出相关敏感噬菌体并调制出合适的“噬菌体鸡尾酒”[38]。此外，一些研究人员认为可以利用基因工程的手段，扩宽噬菌体的宿主谱。例如，将宽谱噬菌体的宿主谱决定基因替换至窄谱噬菌体的基因组中。陈绵绵等[39]发现，在替换噬菌体基因之后，窄谱噬菌体的宿主谱被扩宽，且其后代同时继承了二者的宿主谱。

3.2 有毒性或耐药性基因

在自然环境中，噬菌体是推动细菌进化的重要动力，二者之间存在着频繁的基因水平转移。因噬菌体可能会携带有毒性或耐药性基因[40]，在噬菌体侵染宿主的过程中也很有可能将这种基因转入宿主细胞。

曾振灵等[41]发现不同环境来源噬菌体的基因组中携带有大量的耐药性基因(ARG)，这些噬菌体极有可能将这些基因转导至宿主细胞内，使宿主细胞获得耐药性。噬菌体基因水平转移的方式多样，有转导、转化等转移方式[42]。

研究人员在食品、农田土壤等领域均检测出含ARG的噬菌体颗粒，这些噬菌体能长时间存活并可能成为耐药性基因传递的载体[43-44]。Gabashvili等[45]研究发现，噬菌体转导参与了一些人类和动物细菌病原体自然种群中与抗生素抗性相关的blaCTX-M、mel和tetM基因座的跨基因传播。

因此，在将噬菌体投入实际应用时，特别是应用于环境工程等可控能力不强的领域时，必须明确所使用的噬菌体有无毒性或耐药性基因，以保证制剂的有效性，需防止产生新的“耐药细菌”。

3.3 抗噬菌体细菌的产生

Synnott等[46]从生活污水进水中分离出金黄色葡萄球菌特异性裂解噬菌体。在分批共培养试验[47]中，金黄色葡萄球菌对该噬菌体Φ产生了耐药性。研究人员猜测，噬菌体的使用常常给抗噬菌体细菌的选择带来压力，从而导致耐药性的出现。

细菌在噬菌体的选择压力下进化出一系列抗性机制，包括限制修饰系统(R-M系统)、簇状规则散布的短回文重复序列-Cas系统(CRISPR-Cas系统)等[48]。噬菌体也进化出了抗CRISPR蛋白等物质或机制来打破细菌的抗性机制，使细菌对其重新敏感[49]。

在自然条件下，细菌会进化出对噬菌体的抗性，噬菌体也在不断地进化和适应，以期产生新的蛋白或新的感染机制。二者的协同进化在自然界中十分常见，但在噬菌体实际应用时，则体现在投加噬菌体之初有非常好的杀菌效果，但是当细菌数量减少到一定水平时，细菌死亡的速度开始减缓并最终趋于平衡，使得噬菌体治疗的最终效果未知[50]。噬菌体导致的抗药性细菌的出现是实现噬菌体应用的重要障碍，深入了解噬菌体抗性机制对噬菌体的推广应用至关重要。

4 新的应用

上文所论述的局限性限制了噬菌体在污水处理过程中的广泛应用，但随着分子生物学、生物信息学等领域的深入研究与拓展以及噬菌体展示技术等基于噬菌体的新技术的出现让噬菌体的局限性有望得到弥补。同时，噬菌体的应用绝不仅仅局限于利用噬菌体裂解细菌这一特性。

4.1 裂解酶的发现与利用

研究者们在研究噬菌体裂解细胞的机制时发现，双链DNA噬菌体能够通过合成裂解酶来水解宿主菌细胞壁的肽聚糖结构[51]。裂解酶也称为噬菌体编码的内溶素，被认为是治疗耐药细菌感染的有效抗菌剂和抗生素的合适替代品，有可能克服传统噬菌体治疗的一个主要缺点，即噬菌体的狭隘特异性[52]。有报道称[53]，宿主为革兰氏阳性细菌的噬菌体裂解酶也能从外部溶解革兰氏阳性细菌，其宿主范围远大于单个噬菌体。裂解酶作为一种抗菌剂，已经被用于各种生物医学研究中，包括食品科学和微生物检测。在一些动物模型中也有相关的杀菌效果的研究与评测。同时，一些临床试验已证明噬菌体裂解酶具有巨大的应用潜力，甚至可用于人类治疗[54-55]。

从噬菌体到噬菌体裂解酶，其宿主范围有了巨大的拓展。在未来或能发现某种广谱裂解酶，用于杀灭某一大类丝状菌或病原菌，从而绕过噬菌体窄谱的局限性，有效快速地灭活目标细菌。

4.2 温和噬菌体的研究与应用

温和噬菌体能够通过特殊的转导途径介导细菌间基因转移，存在传播抗生素耐药性、增强细菌毒性的风险，因此，在长久以来的噬菌体应用研究过程中，温和噬菌体是被避免使用的。但是，测序技术和合成生物学的进展为探索利用温和噬菌体治疗细菌感染提供了新的机遇。目前，已经有不少关于温和噬菌体的应用策略被开发并进行了试验测试，包括降低细菌负荷、与烈性噬菌体混合以增强烈性噬菌体的裂解能力、设计基因工程噬菌体、将抗生素敏感性的基因传递给具有产生抗生素抗性的细菌以恢复抗菌药物敏感性等[56]。

污水厂是抗生素污染污水的接收处，同时也是各种细菌混合滋生的聚集地。进水中残留的抗生素与病原菌在各种处理构筑物内混合接触，使得细菌突变产生耐药性的几率大大上升。此外，城市污泥存在抗性菌的可能性更高。葛峰等[57]对从南京市4个污水处理厂的活性污泥中分离出的35株细菌进行抗生素耐药性分析，97.1%的菌株具有不同程度的抗生素耐药性，且80%的菌株具有多重耐药性。金明兰等[58]在某污水厂二级处理出水中检测出磺胺类药物的抗性菌，这种病原菌若随出水或污泥进入自然环境，将对环境及人体健康带来风险。如果能够在污水厂出水之前，利用工程温和噬菌体使目标病原菌对抗生素恢复敏感，削弱其存活能力；或与烈性噬菌体组合以加强噬菌体的灭菌能力，则有可能从源头解决病原菌耐药性问题。

正如上文所述，噬菌体尾部纤维蛋白、裂解酶等噬菌体蛋白质已经在医疗、食品等诸多领域进行了试验应用。相较于噬菌体，噬菌体蛋白质具有更宽的宿主谱以及组织渗透性。随着噬菌体遗传学和生物学知识的不断深入，噬菌体和噬菌体衍生颗粒已经在医疗、诊断、细菌检测、食品保存、动物育种和农业等领域得到了广泛的试验应用[59]，为噬菌体在污水处理中的应用提供了一定的试验背景与技术手段，同时也为噬菌体在污水处理中的应用提供了新的发展方向。

5 总结

污水处理效果的好坏不仅关系到环保事业，同时也关系着每一个人的健康。污水处理工艺的改进不仅在于提高出水水质，更在于提高出水的安全性以及降低处理成本。噬菌体是一种专性侵染细菌，是能够自体复制且快速扩散的生物制剂。长久的研究发现，在应用时，噬菌体优于抗生素，拥有巨大的应用潜力。但是，噬菌体应用目前还尚存着一些诸如特异性过强、隐含抗性或毒性基因等缺陷，使得距离噬菌体在实际中应用仍有一段距离。此外，社会问题也是噬菌体应用所必须面对的现实问题。尽管一些噬菌体制剂已经被某些官方机构承认，但是噬菌体制剂作为一种新型的生物试剂，需要更加严苛的管理制度，同时也需要提供更加充足的证据来证明其对人类或环境是足够安全的。