基于主成分分析微波提取圆头蒿多糖工艺中单糖组分变化

郭淑娟,朱晟永,贾 悦,李 敏,王露露,李 丽,王俊龙,2,赵 潇,2,*(.西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州 730070;2.甘肃特色植物有效成分制品工程技术研究中心,甘肃兰州 730070)

近年来,天然多糖被公认为天然免疫调节剂,具有抗肿瘤[1]、抗病毒[2]、抗氧化[3]等免疫调节功能[4],具有很高的利用价值,被广泛应用于食品、医药和化妆品等领域[5]。圆头蒿(ArtemisiasphaerocephalaKrasch)作为一种菊科植物,广泛分布于我国西北部和蒙古国的荒漠地带[6]。其种籽富含植物油脂和多糖,具有潜在的生物质能源价值[7-8]。因此,从圆头蒿种籽中高效提取圆头蒿多糖(ASP),研究提取工艺对ASP单糖组分的影响,对于进一步充分利用天然生物资源具有一定的意义。

在众多的多糖提取过程中[9],微波辅助提取法是常用且高效的提取方法[10-15],在电磁场的作用下能够有效分离多糖中的主要组分,并且具有加热充分、减少溶剂用量、易于控制等优点[16]。然而,微波提取工艺条件对多糖的单糖组分有着不可忽略的影响,例如微波提取短时间内对细胞膜破碎作用较大,可能会降低了某些反应的活化能,或使多糖内部自身的化学键断裂,发生裂解,生成小的分子片段降低分子质量等一系列不定因素[17]。其次,单糖组成及含量的变化将直接影响多糖发挥生物活性,Ferreiraa等[18]在研究中报导,不同的单糖组成和糖链连接方式直接影响了多糖的免疫调节活性。最近研究也表明含有葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的多糖更能有效刺激正常脾淋巴细胞增殖增强免疫活性[19]。因此有必要对微波提取工艺中对单糖组分含量的影响因素进行分析研究,为进一步探究多糖的构效关系提供基础。

主成分分析(Principal component analysis,PCA)[20-21]是一种标准的数据分析方法,被广泛应用于很多科学领域,如生物统计学、神经系统科学和化学数据分析等。该方法通过少数的结果因子描述各因素之间的相互关系以及内部框架,并且计算出的新指标要尽可能不相关并全面的反应原始变量的信息,便于在研究复杂问题时能够抓住主要的信息,从而更容易掌握主要原因,更容易清楚的了解事物的内部联系[22-23]。本文利用SPSS软件[24]中的主成分分析法对不同微波提取工艺得到ASP的六种单糖进行降维分析,利用提取出的主成分将六种单糖分类,最后通过成分得分矩阵的数据比较成分得分系数分析出不同条件下主要变化的单糖。此外,利用统计学的方法,不仅能够有效对实验数据中微波提取三变量的影响权重进行分析,而且对圆头蒿多糖中的重要单糖组分进行分析得出结论,为进一步的开发利用提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

圆头蒿胶 上海鼎芬化学科技有限公司;95%乙醇、氯仿、正丁醇、浓硫酸、氢氧化钠、三氯乙酸、苯酚(分析纯重蒸馏试剂)、三氟乙酸(TFA,4 mol/L)、盐酸羟胺、吡啶、乙酸酐、无水硫酸钠、氯仿 分析纯(≥98%),单糖标品(L-鼠李糖、D-来苏糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖) 色谱纯(≥99%),晶纯生化科技股份有限公司。

BL320H型电子天平 岛津公司;SB-35型旋转蒸发仪 东京理化器械株式会社;TSQ-8000气相-质谱联用仪 赛默飞世尔科技公司;集热式磁力搅拌器 常州申光仪器有限公司;DZF-6020型真空干燥箱 上海爱朗仪器有限公司;DZKW-4型电子恒温水浴锅 河南天帝电子科技有限公司;UV751GD紫外/可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;TGL-16B高速台式离心机 北京松源华兴科技发展有限公司;MG08S-2B微波实验仪 南京江研微波系统工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 圆头蒿多糖提取 称取一定量的市售圆头蒿胶粉,按照1∶300 g/mL的料液比与去离子水混合。再按照实验设计的微波提取时间(5、15、30、60、90、120 min)、微波提取功率(100、300、500、700、850 W)和提取温度(40、50、60、70、80、90 ℃)等条件进行微波辅助浸提(其中固定因素为60 min、600 W和60 ℃)。提取完毕待冷却后抽滤弃去残渣,滤液以4000 r/min离心10 min,将上清液旋转蒸发浓缩到原体积的1/5,加入95%的乙醇,终体积为80%,静置后将多糖沉淀,然后再次4000 r/min离心10 min,弃去上清液,向离心管内加入少许蒸馏水,用玻璃棒搅拌使之溶解后倒入培养皿中,再加入95%的乙醇沉淀,冷冻干燥,得到圆头蒿多糖(ASP)[25]。

1.2.2 GC-MS单糖组成分析方法 前期研究结果表明[25],ASP由L-阿拉伯糖、D-木糖、D-来苏糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖六种单糖组成,摩尔比为1∶4.98∶1.69∶27.86∶3.76∶13.92,其中甘露糖和半乳糖为主要单糖组成成分。GC-MS单糖组成分析方法参照实验室先前研究[25-26]。

1.2.2.1 样品水解 10 mg的ASP样品(精密天平称量)放入20 mL反应瓶中,加入5 mL三氟乙酸(TFA,4 mol/L),120 ℃下氮气保护水解8 h,加压至0.8 MPa蒸干TFA。

1.2.2.2 水解产物的衍生化 水解后的样品加入10 mg盐酸羟胺和2 mL吡啶,90 ℃下反应30 min,冷却后加入2 mL乙酸酐,90 ℃下乙酰化反应30 min,减压蒸干,加少量氯仿溶解,进行GC-MS分析。

1.2.2.3 单糖组成的GC-MS分析 气相色谱条件:柱子:HP-5MS(30 m×0.32 mm×0.20 μm);进样口温度:250 ℃;进样量:3 μL;气体:He;流速:1.0 mL/min。质谱条件:扫描范围:35～600 u;EI离子源;离子源温度:250 ℃;四级杆温度:160 ℃。得到的图谱使用NIST谱库进行检索。将样品与标准单糖的色谱峰保留值进行对照以确定样品中单糖的种类,采用色谱峰面积归一化法测定样品中单糖的摩尔比例。

1.3 数据处理

数据标准化,运用SPSS分析中的主成分分析时,需要将所得数据进行标准化处理,解决不同量纲之间的单位问题。数据经过整理后,利用SPSS 19.0进行描述统计操作,将数据标准化后进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 单糖组成及其含量分析

本研究利用GC-MS联用技术检测ASP中单糖组分的乙酰化产物含量,以此来测定ASP在不同微波提取条件下样品单糖组成的变化,来初步探讨微波提取对单糖组成的影响及多糖内主要单糖的变化趋势。其次,使用主成分分析法基于不同微波提取条件(时间、功率和温度),对ASP中的单糖组分进行研究,并通过SPSS软件进行数据处理及分析。

2.1.1 不同微波提取时间条件下ASP中单糖组分分析 微波提取时间直接影响着反应基质中极性分子在磁场内快速、定向的排列,以及极性分子之间产生撕裂和相互摩擦的程度[27]。图1展示了在不同时间梯度下经微波处理的ASP样品中6种单糖组分含量的变化。

图1 微波提取时间对ASP各单糖组分含量的影响Fig.1 Influence of microwave extraction time on the monosaccharide composition content of ASP注:A:来苏糖;B:阿拉伯糖;C:木糖;D:甘露糖;E:葡萄糖;F:半乳糖；图3、图5同。

由图1可以看出,改变微波提取时间,圆头蒿多糖的单糖组分含量均发生了不同程度的变化。其中来苏糖的含量变化较复杂,这可能是由于来苏糖作为含量较少的极性分子,更容易在微波热效应下产生高速振动,致使不稳定的热点产生从而导致其单糖组分含量变化复杂[28]。此外,阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的含量呈现出规律性的变化:单糖组分含量在30 min前呈现增加趋势,随着微波提取时间继续延长单糖组分含量明显下降,这是因为在短时间范围内微波提取时间越长,微波作用越充分,植物细胞壁破裂导致多糖溶出越充分,但到达一定时间后样品中水分被蒸干,因此时间继续延长单糖组分出现下降的趋势[29-30]。卫强等[31]在紫荆花多糖的微波提取工艺优化研究中发现,在4～24 min的微波提取过程中紫荆花多糖的提取量与时间存在明显的正相关趋势。王一峰等[32]在微波提取工楤木根皮多糖的研究中同样也证明了在微波提取40 min内楤木根皮多糖的提取率明显上升,随着辐照时间的延长多糖提取率明显下降。

Gharibzahedi等[33]在研究中也报道了类似的结果,其研究表明在超声波-微波辅助提取无花果多糖的过程中各单糖组分在0～60 min范围内出现先增加后降低的变化趋势。因此,可以推断出在短时间范围内微波提取对ASP单糖组分含量的影响呈现增加趋势,并且在600 W,60 ℃的提取条件下ASP的最适提取时间在30～60 min之间。

主成分表达式:

F1=-0.24X1-0.08X2+0.219X3+0.249X4+0.257X5+0.197X5

式(1)

F2=-0.188X1+0.489X2-0.271X3-0.222X4+0.151X5+0.347X6

式(2)

根据表1中可知,在不同时间条件下微波提取的ASP中,六种单糖提取出的主要成分有两个,第一主成分特征值=3.633>1,贡献率为60.549%,第二主成分的特征根=1.852>1,贡献率为30.886%,两个主成分的累计贡献率到达91.415%,即两个主成分解释了不同时间条件下六种单糖变化程度的91.415%,结果说明提取出两个主成分是全面的。李莎等[34]、宋瑞琦等[35]和Aksic等[36]分别在关于单糖组成主成分分析的研究中利用主成分特征值解释了单糖组分变化程度,证实了提取出主成分的全面性。

表1 解释的总方差Table 1 Total variance of interpretation

表2和图2表示了提取出的主成分与原始数据之间的相关程度,即提取出的主成分含有原始变量的数据[37]。根据文献所报道,在九香虫及相似品的多糖组成分析研究中,通过成分得分矩阵和主成分分析图清晰反映出不同单糖组分之间的差异性,以及单糖组分的变化关系[34]。从表2中可以看出,第一主成分与甘露糖、半乳糖和葡萄糖的相关系数都接近1>0.85,说明较全面的包括了这三种单糖的变化信息,而阿拉伯糖的信息涵盖较差。第二主成分中阿拉伯糖的相关系数接近1,说明涵盖阿拉伯糖信息,而其他五种单糖的相关系数较低,对第二主成分的解释程度较差。因此在不同微波提取时间下提取的ASP中,来苏糖、木糖、甘露糖和半乳糖的变化程度比阿拉伯糖的变化幅度大。Cheng等[38]也报导了类似的结论,通过主成分分析法明确阐述了在决明子多糖提取过程中,微波提取时间对甘露糖和半乳糖的组分含量影响较大。因此,通过该分析方法能够清晰的反映在不同微波提取时间条件下微波辅助提取的ASP中主要单糖组分的含量变化明显。

表2 成分得分矩阵及成分得分系数矩阵Table 2 Component score matrix and component score coefficient matrix

图2 不同微波提取时间条件下ASP中单糖主成分荷载图Fig.2 Principal component load diagram of monosaccharides in ASP under different microwave extraction time

2.1.2 不同微波提取功率条件下ASP中单糖组分分析 微波提取法主要利用微波能量穿透进入基质内部,然而影响微波能量大小的关键因素来源于微波功率的大小[16]。因此该部分主要讨论不同微波提取功率对单糖组分的影响。图3显示了不同提取功率处理下ASP样品中的6种单糖的含量变化趋势,且总体变化规律与不同微波提取时间条件下保持一致。研究发现不同点在于含量较低的来苏糖组分变化规律异于其他单糖组分,其在850 W功率时含量下降,推测这是由于来苏糖分子,在高功率的微波提取下高速振动产生过高的热量,其分子结构遭到破坏致使其单糖组分含量呈现下降趋势[27]。因此可以得出结论在60 min,60 ℃的提取条件下ASP的最适提取功率为400～600 W。

图3 微波提取功率对ASP各单糖组分含量的影响Fig.3 Influence of microwave extraction power on the monosaccharide composition content of ASP

根据表3可知,与2.2.1不同的是,在不同微波提取功率条件下处理的ASP中提取出了三个主要成分并且累计贡献率到达97.542%,即从三个主成分全面解释了不同功率条件下六种单糖变化程度的97.542%。其次,根据表4和图4主要反映出第一主成分与甘露糖和葡萄糖的相关系数都接近1>0.85,说明较全面的包括了这两种单糖的变化信息,其中半乳糖的信息涵盖较差。然而,第二主成分中半乳糖的相关系数接近1,说明涵盖半乳糖信息,而其他五种单糖的相关系数较低,对第二主成分的解释程度较差。此外,单糖组分总体变化规律与2.2.1相同,不同之处在于低含量的木糖组分变化幅度减小,因此可以推断出改变微波提取功率对含量较高的主要单糖组分影响较大。谭等[39]在对人生花多糖的研究中发现,改变微波提取功率其单糖组分中除鼠李糖外其他七种单糖含量的变化较大。因此,可以看出微波提取功率对多糖中含量低的单糖组分影响较小,且影响类别与程度存在底物差异性。

表3 解释的总方差Table 3 Total variance of interpretation

表4 成分得分矩阵及成分得分系数矩阵Table 4 Component score matrix and component score coefficient matrix

图4 不同微波提取功率条件下ASP中单糖主成分荷载图Fig.4 Principal component load diagram of monosaccharides in ASP under different microwave extraction power

2.1.3 不同微波提取温度条件下ASP中单糖组分分析 由图5可以看出,提取温度为40～90 ℃的过程中,随辐照温度的增大,单糖的组成均发生了不同程度的变化。虽然在该条件下,每种单糖的含量未呈现出规律性的变化,但在该提取温度范围内随着温度的升高,各单糖的含量均存在一个最大值和最小值。因此可以发现提取温度区间在50～70 ℃,对有效保留不同单糖组分有着明显的作用。刘超[40]在研究中也发现用微波辅助提取羊肚菌胞内多糖的过程中,在提取温度为70 ℃的条件下半乳糖含量最高,半乳糖组分得到了有效的保留。此外,从实验数据可以看出提取温度导致ASP单糖组分含量的变化程度均小于微波提取时间和功率。

图5 微波提取温度对ASP各单糖组分含量的影响Fig.5 Influence of microwave extraction temperature on the monosaccharide composition content of ASP

在不同提取温度条件下的ASP中,提取出了两个主要成分同2.2.1,第一主成分特征值=3.372>1,贡献率为59.196%,第二主成分的特征值=1.685>1,贡献率为28.087%,且累计贡献率到达84.283%,即两个主成分全面地解释了不同提取温度条件下六种单糖变化程度的84.283%。表6和图6代表了提取出的主成分与原始数据之间的相关程度,即提取出的主成分含有的原始变量的数据。从表6中可以看出,第一主成分和第二主成分分别与葡萄糖和甘露糖的相关系数接近1,分别说明较全面的包括了葡萄糖和甘露糖的变化信息,而其他糖的信息涵盖较差,并且对第二主成分的解释程度较差。因此在不同提取温度条件下提取的ASP中,

表5 解释的总方差Table 5 Total variance of interpretation

表6 成分矩阵及成分得分系数Table 6 Component matrix and component score coefficient

图6 不同温度条件下ASP中单糖主成分荷载图Fig.6 Principal component load diagram of monosaccharides in ASP under different extraction temperature

葡萄糖的变化程度大于甘露糖,且变化幅度明显大于其他单糖组分。研究说明利用微波提取ASP在改变提取温度的条件下仅对葡萄糖含量的影响最为明显。与2.2.1和2.2.2相比,提取温度这一因素,在微波辅助提取ASP的过程中影响权重较低。这是因为微波本身可以在短时间内产生很大的热能[16],破坏活性物质的稳定性,在一定温度范围内改变提取温度条件,对提取物质的影响很小[17]。

3 结论

本研究对微波辅助提取ASP的单糖组成及组分含量的分析结果表明随着微波提取条件(辐照时间、辐照功率和提取温度)的增加,各单糖组分含量均呈现先增加后降低的总体变化趋势。通过SPSS对不同处理条件下得到的单糖组分数据进行主成分分析研究,可以发现微波提取时间、功率和温度三种影响因素均导致ASP中主要单糖组分含量明显变化,其中微波提取时间的改变对单糖组分的影响最为显著。本研究为微波辅助提取技术在多糖领域中的应用及工艺优化提供了技术支持和数据支持。