不同产地木豆叶中5种黄酮类成分含量的比较及聚类分析

黎映琼 蔡庆群 苏志强 陈标妹

摘要 [目的]建立木豆葉中5种黄酮类成分含量的测定方法，比较不同产地木豆叶中5种黄酮类成分的含量并对其进行聚类分析。[方法]采用HPLC-DAD建立木豆叶中5种黄酮类成分（荭草苷、牡荆苷、木犀草素、染料木素、球松素）的含量测定方法，色谱柱为 Agilent Zobax Eclipse XDB-C 18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长330 nm，柱温为30 ℃;通过IBM SPSS 22.0对不同产地木豆叶进行聚类分析。[结果]5种对照品在相应浓度范围内与峰面积均呈现良好的线性关系;回收率均在90%～110%;不同产地木豆叶中5种黄酮类成分含量差异较大，基于5种黄酮类成分含量对不同产地的木豆叶聚类结果表明，木豆叶可分为2组，其中一组5种黄酮总量基本都大于0.5%，另一组则基本小于0.5%，但是并无明显产地聚类特性。[结论]该研究建立的木豆叶5种黄酮类物质含量测定方法准确、可靠，可用于木豆叶中5种黄酮成分的含量测定;根据聚类分析表明，不同产地木豆叶质量参差不齐，可以优选黄酮含量高的品种进行选育，从而保证药材来源的质量稳定性以及用药安全性。

关键词 木豆叶;不同产地;黄酮;聚类分析

中图分类号 R284  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2020）20-0203-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.054

Comparison and Cluster Analysis of Five Flavonoids in Cajanus cajan Leaves from Different Producing Areas

LI Ying-qiong， CAI Qing-qun， SU Zhi-qiang et al

（The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510405）

Abstract [Objective] To establish a method for determining the content of five flavonoids in Cajanus cajan leaves and comparing the content of five flavonoids in Cajanus cajan leaves from different regions and perform cluster analysis. [Method] An HPLC method was developed for the determination of five flavones （Humulusside， vitexin， luteolin， genistein， pinostrobin） in the Cajanus cajan leaves. The chromatographic column was Agilent Zobax Eclipse XDB-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）;gradient elution using methanol （A）-0.1% formic acid aqueous solution （B） as the mobile phase;flow rate was set at 1.0 mL/min;detection wavelength was set 330 nm;column temperature was set at 30 ℃;the content of five flavonoids of Cajanus cajan leaves from different areas were detected using the above methods;cluster analysis of Cajanus cajan leaves of different origins by IBM SPSS 22.0 was conducted. [Result] The five reference products showed a good linear relationship with the peak area in the corresponding concentration range;the recovery rates were between 90% and 110%;the content of the five flavonoids in the leaves of Cajanus cajan leaves from different places varied widely. The clustering results based on the content of five flavonoids showed that Cajanus cajan leaves from different places can be divided into two groups. The total amount of flavonoids in one group is basically greater than  0.5%， and the other group is basically less than 0.5%， but there is no obvious clustering characteristics of origin. [Conclusion] The method for determining the content of five flavonoids in Cajanus cajan leaves is accurate and reliable. It can be used to determine the content of five flavonoids in Cajanus cajan leaves. According to the cluster analysis， the quality of Cajanus cajan leaves varies from place to place， and varieties with high flavonoid content can be selected for breeding， so as to ensure the quality stability of the medicinal materials and the safety of the medication.

Key words Cajanus cajan leaves;Different producing areas;Flavones;Cluster analysis

木豆叶，又名柳豆叶，为豆科植物木豆[Cajanus cajan（L.）Millsp.]的干燥叶。木豆为豆科木豆属落叶灌木 [1-2]，主要分布于长江以南的海南、云南、广西、贵州、广东以及福建、湖南、四川、江西、浙江、台湾等省区 [3]，它既是重要的木本粮食作物，也是一种重要的药用植物，为广东、广西、海南地区习用中药，具有活血化瘀、消腫止痛、补肾健骨、祛腐生肌之功效。现代研究表明，木豆叶具有抗炎 [4]、降脂 [5]、抗骨质疏松 [6]、抗股骨头坏死 [7-8]等作用。

木豆叶主要活性成分为黄酮类化合物，包括荭草苷、牡荆苷、芒柄花苷、染料木素、木犀草素、球松素等 [2，9]。然而目前关于其黄酮类的研究主要在于药理以及总黄酮提取工艺方面 [10-11]，黄酮类含量测定主要集中在对其牡荆苷单一成分定量研究 [12-13]，少见多种成分同时测定的文献报道。采用单一指标性成分含量进行中药材质量控制存在一定缺陷，因此，笔者采用HPLC同时测定木豆叶中5种黄酮类成分（荭草苷、牡荆苷、染料木素、木犀草素、球松素）的含量，并对来自不同产地的20批次木豆叶进行含量及聚类分析，以期为木豆叶的质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材。不同产地木豆叶采集信息见表1。各木豆叶样品经实验室通过ITS通用引物序列鉴定为豆科植物木豆。

1.1.2 试剂。对照品染料木素（批号B21039，含量98%）、木犀草素（批号B20888，含量98%），购自上海源叶生物科技有限公司;球松素（批号BD8743，含量95%）、荭草苷（批号306855，含量95%），购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;牡荆苷（批号137309，含量98%），购自百灵威科技有限 公司。

1.1.3 仪器。LC-20A型高效液相色谱仪，检测器为Prominence SPD-M20A PDA检测器（日本岛津）;Heal Force Smart超纯水系统（香港力康生物医疗科技控股集团）;MS105型1/100 000电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 供试品的制备。将木豆叶样品充分干燥粉碎后，精密称取0.5 g，置50 mL锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，称定，超声30 min，放冷，补重，过滤，滤液经微孔滤膜 （0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。

1.2.2 对照品的制备。精密称取5种黄酮类对照品适量，加入甲醇，配制成含牡荆苷0.101 5 mg/mL、荭草苷 0.384 5 mg/mL、染料木素0.123 4 mg/mL、木犀草素 0.202 5 mg/mL、球松素 0.167 8 mg/mL的对照品储备液。

1.2.3 HPLC分析条件。色谱柱为Agilent Zobax Eclipse XDB-C 18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）为流动相。洗脱梯度：0～10 min，10%～50% A;10～50 min， 50%～80% A;50～60 min，80% A;60～62 min，80%～10% A;62～ 72 min，10%A。流速为1.0 mL/min，检测波长 330 nm，柱温 为30 ℃。

1.2.4 标准曲线考察。取“1.2.2”对照品储备液进行梯度稀释后按照“1.2.3”条件进行进样分析，以进样量（μg/mL）为横坐标（X）、峰面积积分值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算得5种黄酮成分的回归方程和线性范围。

1.2.5 方法学考察。

1.2.5.1 精密度考察。取“1.2.1”同一份供试品溶液10 μL，根据该研究色谱条件重复进样6次，获得荭草苷等5种黄酮类成分峰面积值，计算得5种成分峰面积RSD值。

1.2.5.2 稳定性考察。精密吸取“1.2.1”同一份供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、8、12、16、24 h进样，测定不同时间条件下各成分的峰面积并计算RSD值。

1.2.5.3 重复性考察。精密称取同一批次木豆叶样品6份，按照“1.2.1”供试品制备方法制备样品，分别进样10 μL，计算5种黄酮类成分含量的RSD值。

1.2.5.4 加样回收率考察。精密称取已知含量的木豆叶样品6份，每份各0.5 g，按照供试品中黄酮-黄酮对照品含量 1∶1的比例添加5种对照品，按“1.2.1”制备供试品，按“1.2.3”色谱条件分别进样，计算回收率和RSD。

1.2.6 不同产地木豆叶样品含量测定。不同产地木豆叶经充分干燥制备供试品后，按照“1.2.3”色谱条件进样分析并计算含量。

1.2.7 聚类分析。通过IBM SPSS 22.0基于5种黄酮含量对不同产地木豆叶进行聚类分析。以5种黄酮含量为变量，采用SPSS对数据进行标准化处理，以平方欧氏距离为测度进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 木豆叶5种异黄酮类成分HPLC图谱

按“1.2.3”条件操作，木豆叶5种黄酮类成分分离度好，均大于1.5，且阴性无干扰，专属性强（图1）。

2.2 标准曲线 按“1.2.4”操作，结果见表2。由表2可知，5种成分进样量与峰面积之间有良好的线性关系，标准曲线 r均大于0.999。

2.3 方法学考察结果

2.3.1 精密度。按“1.2.5.1”操作，计算得5种成分峰面积的RSD值分别为0.33%、0.25%、1.86%、1.28%、1.45%，均小于 2.00%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性。按“1.2.5.2”操作，计算得5种成分峰面积的RSD值分别为1.34%、1.49%、0.99%、0.78%、0.98%，均小于 2.00%，表明供试品溶液稳定性较好。

2.3.3 重复性。按“1.2.5.3”操作，计算得6份样品中5种黄酮类成分含量分别0.142%、0.160%、0.002%、0.015%、 0.158%，RSD值分别为0.22%、1.58%、1.22%、3.04%、2.11%，均小于3.00%，表明该方法重复性较好。

2.3.4 加样回收率。按“1.2.5.4”操作，计算得木豆叶中5种黄酮类成分的平均加样回收率分别为100.01%、98.45%、 98.34%、95.14%、103.45%，RSD值分别为1.49%、1.35%、 2.18%、2.33%、 1.45%，加样回收率在95%～105%，RSD均小于3%，说明方法准确度高。

2.4 不同产地木豆叶样品的黄酮类成分含量

由表3可知，不同产地木豆叶5种黄酮类成分含量差异较大，荭草苷含量在 0.048%～0.239%，牡荆苷含量在0.054%～0.269%，染料木素含量在0.000%～0.004%，木犀草素含量在0.000%～ 0.015%，球松素含量在0.004%～0.241%，5种黄酮总含量在0.175%～0.728%。

2.5 聚类分析

由图2可知，根据黄酮含量高低可将不同产地木豆叶分为2组：YN-6、SC-1、YN-7、YN-5、GX-2、 YN-3、YN-4、SC-2为第1组，该组木豆叶5种黄酮总量基本都低于0.5%;GX-3、GX-4、GX-1、YN-2、GX-5、YN-1、 HN-1、HN-2、HN-3、GD-1、GD-2、GD-3为第2组，5种黄酮总量基本都超过0.5%。

3 结论与讨论

（1）目前总黄酮的提取方法包括加热回流法、超声提取法以及表面活性剂辅助酶法等 [14-16]。基于超声提取法的方便性，该研究采用超声提取法开展了试验，结果表明，该提取方法能有效、方便地提取出木豆叶中的黄酮类成分，杂质干扰较少。

（2）该研究采用DAD检测在190～400 nm紫外波长下进行全波长扫描，结果表明：5种成分在波长330 nm条件下有较强的吸收，且基线平稳，因此选择330 nm作为最终试验检测波长。

（3）该研究根据木豆叶主要活性成分研究的相关文献 [17-18]，选择其中的5个黄酮类成分荭草苷、牡荆苷、球松素、染料木素以及木犀草素作为指标进行含量测定，结果表明，所建立的含量测定方法操作方便、专属性强、准确性高，且能同时检测木豆叶中的5种成分，可用于木豆叶黄酮类成分的含量测定及其质量控制。

（4）將该方法应用于不同产地木豆叶黄酮类成分含量比较，结果表明：不同产地木豆叶的含量差异较大。为了确保药材来源的稳定性、有效性以及安全性，后续可对黄酮类成分含量较高的木豆叶进行选育工作，从而确保该性状的稳定遗传。

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