多指标权重分析与正交设计法优选黄芪女贞方菌质醇沉工艺

王红丽，刘效栓，李季文，戚鹏飞，马琴国，张中华，郭敏，肖正国，罗燕燕

多指标权重分析与正交设计法优选黄芪女贞方菌质醇沉工艺

王红丽1，刘效栓1，李季文1，戚鹏飞2，马琴国1，张中华1，郭敏1，3，肖正国1，罗燕燕1

1.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2.兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州 730050；3.甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050

采用多指标正交试验优选黄芪女贞方菌质的最佳醇沉工艺。以黄芪甲苷、特女贞苷转移率及干膏得率为评价指标，选择药液浓缩比（A）、乙醇浓度（B）、含醇量（C）、醇沉时间（D）为考察因素，进行L9（34）正交试验，结合层次分析法及多指标试验全概率评分法优选最佳醇沉工艺。建立了黄芪女贞方菌质中黄芪甲苷、特女贞苷含量的HPLC测定方法。以黄芪甲苷转移率为评价指标，影响因素为C3＞B3＞A2＞D2；以特女贞苷转移率为评价指标，影响因素为A3＞D2＞C2＞B3；以干膏得率为评价指标，影响因素为A3＞C1＞B3＞D2。加权评分优化后确定的最佳醇沉工艺为：菌质∶提取液＝1∶1.5，采用85%乙醇，含醇量75%，醇沉18 h。黄芪女贞方菌质中黄芪甲苷和特女贞苷在优选的醇沉工艺条件下转移率较高，达到较好的纯化效果，工艺稳定可行，可为进一步研究提供依据。

黄芪女贞方菌质；多指标综合评分法；层次分析法；醇沉工艺；含量测定

近年来，发酵技术与中药研究联合，形成了真菌发酵工艺应用技术。利用中草药发酵的研究从单味药发展到复方[1]，微生物发酵技术已成为中药现代化研究的重要内容之一。豆豉、神曲、红曲、半夏曲等就是采用发酵法制成的一类独具特色的中药[2]。研究表明，通过微生物代谢能够增强中草药的疗效、产生新的活性成分、降低毒副作用、提高生物利用度[3]。黄芪女贞方可补气养阴、调节免疫，用于久病虚损、气阴不足，在临床恶性肿瘤治疗中配合手术、放疗、化疗，促进机体功能恢复[4-5]。黄芪女贞方菌质由益气滋阴补肾药黄芪和女贞子饮片按一定比例经内生菌发酵制成[6]。本课题前期研究发现，真菌菌种发酵有利于富集黄芪女贞方有效成分，发酵过程中产生的活性酶能将黄芪、女贞子中的纤维素类、淀粉类、蛋白质类成分进行分解，使有效组分更好地溶出。

本试验采用水提醇沉工艺，以黄芪甲苷、特女贞苷转移率及干膏得率为评价指标，选择药液浓缩比、乙醇浓度、含醇量、醇沉时间为考察因素，以L9（34）正交试验结合层次分析法（AHP）及多指标试验全概率评分法优选最佳醇沉工艺，进一步去除杂质，降低干膏得率以减少服用量，为处方制剂工艺奠定基础。

1 仪器与试药

1260型高效液相色谱仪（四元泵，自动进样器，奥泰2000ES蒸发光检测器），美国安捷伦公司；高效液相色谱仪（Waters1525泵，Waters717进样器，Waters2487双通道紫外检测器），Waters公司；JY10001电子天平，上海之信仪器有限公司；AR124CN电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；SB-3200D超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；HWS-24电热恒温水浴锅，上海齐欣科学仪器有限公司；TGL-16高速离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司。

黄芪女贞方菌质，甘肃省中医院科研制剂中心研发部自制。制备方法：称取黄芪、女贞子饮片（2∶1）适量，破碎至粒径为10目，加入适量蒸馏水至初始含水量为110%，混合均匀，置于400 mL发酵瓶内，盖上棉塞，用包装纸包好，121 ℃灭菌30 min，作为发酵培养基。在无菌室内，取真菌菌种适量（接种量10%），平铺接种到固体培养基中，26 ℃培养15 d，至发酵瓶底布满菌丝，即得。批号分别为190514、190515、190516。对照品黄芪甲苷（批号B20564，纯度≥98%）、特女贞苷（批号B21240，纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司。无水乙醇、乙腈、甲醇为色谱纯，正丁醇、氨水、95%乙醇为分析纯，天津市大茂化学试剂厂。

2 方法与结果

2.1 黄芪女贞方菌质水提液制备

结合前期水提取工艺优化结果，将经内生真菌发酵的黄芪女贞方加8倍量水提取3次，每次1.5 h，过滤，滤液合并后浓缩至菌质∶提取液＝1∶1（25 ℃），冷藏备用。

2.2 干膏得率测定

将正交试验所得醇沉液离心，回收乙醇后定容至50 mL，精密吸取5 mL至干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，残渣于105 ℃干燥3 h，取出，迅速置干燥器中，冷却至室温，称重，测定干膏得率。

2.3 黄芪甲苷含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱为CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（32∶68），流速1 mL/min，温度为室温，进样量20 μL。ELSD检测条件：检测器漂移管温度105 ℃，载气（空气）流速2.7 L/min。色谱图见图1。

2.3.2 对照品溶液制备

取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为0.22 mg/mL的对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液制备

精密量取正交试验项下定容的样液各25 mL，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇萃取4次，每次40 mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次40 mL，弃去洗涤液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次20 mL，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.3.4 方法学考察

黄芪甲苷在0.55～4.4 μg范围内线性关系良好，回归方程为＝0.568－2.979 9（＝0.999 8）。精密度试验RSD＝1.21%（＝6），表明本方法精密度良好。取同一批样品6份，按“2.3.3”项下方法制备，测定黄芪甲苷含量，RSD＝1.75%，表明本方法重复性良好。供试品溶液在24 h内稳定性良好，RSD＝2.19%（＝6）。黄芪甲苷平均回收率为97.99%，RSD＝2.67%（＝6）。

注：A.对照品；B.供试品；1.黄芪甲苷

2.3.5 样品含量测定

取“2.3.3”项下供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定峰面积，代入回归方程，计算黄芪甲苷含量。1～9号样液黄芪甲苷含量分别为0.11、0.11、0.14、0.13、0.13、0.13、0.14、0.11、0.13 mg/g。

2.4 特女贞苷含量测定

2.4.1 色谱条件

色谱柱为Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），流动相为甲醇-水（40∶60），流速1.0 mL/min，柱温为室温，检测波长224 nm。色谱图见图2。

2.4.2 对照品溶液制备

取特女贞苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为0.25 mg/mL的对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液制备

精密量取正交试验项下定容的样液各1 mL，水浴烘干，加稀乙醇，50 ℃超声提取（功率250 Ｗ，频率40 kHz）30 min，定容至10 mL容量瓶中，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

注：A.对照品；B.供试品；1.特女贞苷

2.4.4 方法学考察

特女贞苷在0.625～5 μg范围内线性关系良好，回归方程为＝1 847 733.26－44 513（＝0.999 8）。精密度试验RSD＝0.79%（＝6），表明本方法精密度良好。取同一批样品6份，按“2.4.3”项下方法制备，测定特女贞苷含量，RSD＝0.55%（＝6），表明本方法重复性良好。供试品溶液在36 h内稳定性良好，RSD＝1.02%。特女贞苷的平均回收率为101.02%，RSD＝2.35%（＝6）。

2.4.5 样品含量测定

取“2.4.3”项下供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件测定峰面积，代入回归方程，计算特女贞苷含量。1～9号样液特女贞苷含量分别为0.75、0.78、0.75、0.84、0.87、0.85、0.89、0.80、0.90 mg/g。

2.5 正交试验优选醇沉工艺条件

2.5.1 层次分析法确定权重

将黄芪甲苷转移率、特女贞苷转移率、干膏得率作为权重指标，分为3个层次予以量化[7]。根据黄芪女贞方菌质药味处方用量及各因素影响的显著性，确定指标的优先顺序为黄芪甲苷转移率＞干膏得率＞特女贞苷转移率，以此构成成对比较的判断优先矩阵（见表1），得到各项指标的相对评分。根据评分结果，AHP计算得到干膏得率、黄芪甲苷转移率、特女贞苷转移率权重系数分别为0.155 4、0.776 8、0.067 9，一致性比例因子CR＝0.010 4。CR＜0.10即指标优先比较判断矩阵具有满意的一致性，权重系数有效[8]。

表1 指标成对比较的判断优先矩阵

权重指标干膏得率黄芪甲苷转移率特女贞苷转移率 干膏得率11/5 2 黄芪甲苷转移率5110 特女贞苷转移率1/21/10 1

2.5.2 数据处理

采用多指标试验全概率法进行数据处理，以消除单位量纲[9-10]。设Bi为第i号试验，Aj为第j个指标，且A1，A2，A3，…，An互不相容，设各指标的重要程度之比为A1∶A2∶A3，…，Ak＝M1∶M2，…，Mk，则：

P（Aj）＝Mj/N j＝1，2，3，…，k （1）

以Xij表示第j个指标的第i个测定值，以Sj表示第j个指标各次（n次）试验结果的和，即：

则：

P（B1/A1）＝Xi/Sj （3）

P（Bi）k＝∑P（Aj）P（Bi/Ai） i＝1，2，3，…，n （4）

公式（4）即为同时兼顾各指标综合效应的全概率公式。以干膏得率、黄芪甲苷转移率、特女贞苷转移率为指标，结合AHP确定的权重系数，得到综合评分Y的计算公式Y＝P（Bi/A1）×0.155 4×100＋P（Bi/A2）×0.776 8×100＋P（Bi/A3）×0.067 9×100，式中i＝1，2，3，…，n。

2.5.3 正交试验设计

经预试验，影响醇沉工艺的因素主要有药液浓缩比（菌质∶提取液）、乙醇浓度（乙醇体积分数）、含醇量、醇沉时间，采用正交试验设计，每因素设3个水平，考察对醇沉工艺的影响，按L9（34）正交表安排试验，因素水平见表2。

表2 黄芪女贞方菌质醇沉工艺正交试验因素水平表

水平药液浓缩比乙醇浓度/%含醇量/%醇沉时间/h ABCD 11∶1955512 21∶1.5906518 31∶2857524

2.5.4 正交试验方法与结果

取“2.1”项下贮备液（菌质∶提取液＝1∶1）9份，各40 mL，其中3份加水调节至药液浓缩比为1∶1.5，另取3份加水调节至药液浓缩比为1∶2，进行醇沉，加醇量＝醇沉液中乙醇浓度×浓缩液体积÷（添加的乙醇浓度－醇沉液中乙醇浓度）。离心后回收乙醇，定容至50 mL，按“2.2”项下方法测定干膏得率（Y1），按“2.3.3”“2.4.3”项下方法制备供试品溶液并测定黄芪甲苷转移率（Y2）、特女贞苷转移率（Y3），计算综合评分（Y），对所得结果进行直观分析和方差分析，见表3、表4。

由直观分析可知，以干膏得率为指标，各因素的作用为A＞C＞B＞D，工艺组合为A3B3C1D2；以黄芪甲苷转移率为指标，各因素的作用为C＞B＞A＞D，工艺组合为A2B3C3D2；以特女贞苷转移率为指标，各因素的作用为A＞D＞C＞B，工艺组合为A3B3C2D2。分别以极值最小的因素为误差项进行方差分析，结果显示：对于干膏得率，A、C因素有显著影响；对于黄芪甲苷转移率，A、B、C因素均有显著影响；对于特女贞苷转移率，A因素有显著影响。对于综合评分，各因素的作用为C＞A＞B＞D，最佳工艺组合为A2B3C3D2，以极值最小的D因素为误差项，A、B、C三因素对醇沉工艺均有显著影响，故确定优化后的工艺为A2B3C3D2，即药液浓缩比（菌质∶提取液）为1∶1.5，乙醇浓度85%，含醇量75%，醇沉时间18 h。

表3 黄芪女贞方菌质醇沉工艺正交试验结果直观分析

序号ABCDY1/%Y2/%Y3/%Y 1111112.3055.5353.35 9.85 2122212.3357.0755.8310.10 3133312.0768.4653.8011.59 4212313.3267.3259.6911.67 5223113.0067.1861.9111.64 6231215.0963.7760.8311.43 7313213.1970.5763.6212.15 8321314.5054.0457.37 9.98 9332114.6865.1064.0911.60 Y1K112.2312.9413.9613.33 K213.8013.2813.4513.54 K314.1213.9512.7513.30 R 1.89 1.01 1.21 0.24 Y2K160.3564.4757.7862.61 K266.0959.4363.1663.80 K363.2465.7868.7463.27 R 2.85 6.3510.95 1.20 Y3K154.3358.8957.1859.78 K260.8158.3759.8760.10 K361.6959.5859.7856.95 R 7.37 1.21 2.69 3.15 YK110.5111.2210.4211.03 K211.5810.5711.1211.22 K311.2411.5411.7911.08 R 1.07 0.97 1.37 0.19

表4 黄芪女贞方菌质醇沉工艺正交试验结果方差分析

项目方差来源 SSfMSF值P值 干膏得率A 6.1392 3.07059.838＜0.05 B 1.5852 0.79215.444＞0.05 C 2.2112 1.10521.546＜0.05 D（误差） 0.1032 0.510 黄芪甲苷 转移率A 49.413224.70622.936＜0.05 B 67.453233.72631.310＜0.05 C179.937289.96883.522＜0.05 D（误差） 2.1542 1.077 特女贞苷 转移率A 97.082248.54144.401＜0.05 B（误差） 2.1862 1.093 C 13.9522 6.976 6.381＞0.05 D 17.9652 8.982 8.216＞0.05 综合评分A 1.7842 0.89228.458＜0.05 B 1.4572 0.72923.245＜0.05 C 2.8302 1.41545.138＜0.05 D（误差） 0.063210.500

注：0.05（2，2）＝19.00，0.01（2，2）＝99.00

2.5.5 验证试验

取“2.1”项下贮备液（菌质∶提取液＝1∶1）3份，各40 mL，按优选的最佳工艺进行3次试验，离心，回收乙醇后定容至50 mL，按“2.2”项下方法测定干膏得率，按“2.3.3”“2.4.3”项下方法制备供试品溶液并测定黄芪甲苷、特女贞苷含量，计算转移率，结果见表5。

表5 黄芪女贞方菌质醇沉工艺验证试验结果（%）

试验号干膏得率黄芪甲苷转移率特女贞苷转移率 115.48±0.0268.2363.15 215.33±0.0368.1763.08 315.37±0.0267.9263.22

3 讨论

多指标综合加权评分法是目前研究中药复方的常用方法，而权重系数的赋予是综合评分是否科学、合理的直接体现[11]。AHP是一种多维准则决策的数学方法，能将人的主观判断有条理、有层次地予以量化，对权重进行一致性检验以判断矩阵的可接受性，实现定性到定量的转化[12]。

黄芪女贞方经真菌发酵后溶出率增加，成分复杂，以单一指标评价其质量不具有代表性，故本试验在醇沉除杂时，以药效成分黄芪甲苷、特女贞苷转移率及干膏得率为综合评价指标，采用AHP结合多指标试验全概率评分法全面分析，优化得到最佳醇沉工艺，避免以单一指标评价造成的局限性和不准确性。

另外，本试验中黄芪女贞方菌质醇沉前平均干膏得率为26.16%，而醇沉后约为15.39%，在有效成分得到最大保留的同时降低了干膏得率以增加制剂的稳定性和澄清度[13]，减少服药剂量，为后期制备工艺奠定了基础。

有文献报道，药液的相对密度在实际操作中难以控制，故选用药液浓缩比为考察因素，方便实用[14-15]。本研究在浓缩过程中，发现药液浓缩比＞1∶1时流动性变差，冷却后呈半固体状，且醇沉时易成块，造成有效成分损失；药液浓缩比＜1∶2时，易造成乙醇浪费，且醇沉时不易聚结而难以下沉。因此，选择药液浓缩比为1∶1～1∶2范围内的3个水平进行考察。

2015年版《中华人民共和国药典》特女贞苷含量测定项下供试品溶液的制备所用溶媒为稀乙醇[16]。从方差分析结果看，含醇量对特女贞苷转移率无显著影响，考虑与特女贞苷的溶解性有关。

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[16] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社,2015：46.

Optimization on Alcohol Precipitation Technology of Mycoplasm fromPrescription Based on Orthogonal Design and Multi-index Weight Analysis

WANG Hongli1, LIU Xiaoshuan1, LI Jiwen1, QI Pengfei2, MA Qinguo1, ZHANG Zhonghua1, GUO Min1,3, XIAO Zhengguo1, LUO Yanyan1

To optimize the alcohol precipitation technology of mycoplasm fromPrescription through multi-index orthogonal experiment.The transfer rates of astragalosides and specnuezhenide and the yield of dry paste were set as evaluation indexes; The ratio of concentration of liquid medicine (A), ethanol concentration (B), alcohol content (C) and alcohol precipitation time (D) were selected as the study factors; the L9(34) orthogonal test was carried out. The optimal alcohol precipitation process was preferred by the method of analytic hierarchy process and the multi-index trial full-probability scoring method.A method for the determination of astragalosides and specnuezhenide in mycoplasm fromPrescription by HPLC was established. With the transfer rate of astragalosides as evaluation index, the influencing factors were C3>B3>A2>D2; with the transfer rate of specnuezhenide as evaluation index, the influencing factors were A3>D2> C2>B3, and the yield of dry paste was A3>C1>B3>D2. The optimal alcohol precipitation process after the optimization of the weighted score were: the concentration ratio of the liquid medicine (mycoplasm: extracting solution) was 1:1.5; the ethanol concentration was 85%; the alcohol content was 75%; the alcohol precipitation time was 18 h.The transfer rates of astragalosides and specnuezhenide in the optimal alcohol precipitation process are high, and better purification effect is achieved. The process is stable and feasible, which can provide basis for further study.

mycoplasm fromPrescription; comprehensive evaluation method; analytic hierarchy process; alcohol precipitation technology; content determination

R283.5

A

1005-5304(2020)10-0080-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.201911326

甘肃省重点研发计划（17YF1FA106）

王红丽，E-mail：1439662482@qq.com

（2019-11-18）

（2020-02-25；编辑：陈静）