补肾活血方对精索静脉曲张模型大鼠生精功能的影响

刘建国，赵红乐，李姣姣，马亚玲，赵宇涛

补肾活血方对精索静脉曲张模型大鼠生精功能的影响

刘建国1，2，赵红乐1，李姣姣2，马亚玲2，赵宇涛2

1.陕西省中医医院，陕西 西安 710003；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046

观察补肾活血方对精索静脉曲张模型大鼠生精功能的影响，探讨其作用机制。SD雄性大鼠40只，随机抽取8只为假手术组，其余大鼠采用左肾静脉部分结扎法造成精索静脉曲张病理模型，造模成功大鼠随机分为模型组和补肾活血方低、中、高剂量组，每组8只。造模后48 d开始灌胃给药，连续60 d。摘取大鼠左侧睾丸、附睾，称重并计算脏器指数，检测精子浓度、活动率，HE染色观察睾丸病理改变，TUNEL法检测生精细胞凋亡，睾丸组织匀浆检测一氧化氮水平。与假手术组比较，模型组大鼠睾丸、附睾质量及脏器指数明显降低，精子浓度、活动率明显降低，睾丸组织生精上皮明显变薄，大量生精细胞缺失，管腔内几乎无成熟的精子细胞，生精细胞凋亡指数、睾丸组织一氧化氮含量均显著增加；与模型组比较，补肾活血方各剂量组大鼠睾丸、附睾质量及脏器指数、精子浓度及活动率增加，睾丸组织损伤明显恢复，生精细胞凋亡及睾丸组织一氧化氮含量均明显降低。补肾活血方可改善精索静脉曲张模型大鼠生精功能损伤，其机制可能与抑制生精细胞凋亡及减少一氧化氮对睾丸组织的毒性损伤有关。

补肾活血方；精索静脉曲张；精子发生；细胞凋亡；一氧化氮；大鼠

精索静脉曲张是导致男性不育的重要因素之一，其发病率在男性人群中占15%，在不育男性中约占45%[1]。精索静脉曲张可造成睾丸灌注减少，引起精液质量异常、睾丸体积下降及睾丸生精功能障碍等。针对精索静脉曲张的相关研究较多，但其导致男性不育的机制仍未完全阐明。目前，研究重点主要集中在细胞凋亡、氧化应激、一氧化氮（NO）毒性损伤等[2]。中医药在治疗精索静脉曲张所致不育方面有较好疗效，不仅可有效缓解精索静脉曲张症状，还能改善精液参数，调节性激素水平，提高配偶受孕率[3-5]，但其具体机制仍未明了。补肾活血方是笔者根据金保方教授养精胶囊加减化裁而成，具有补肾填精、养血活血功效。前期临床研究表明，补肾活血方可改善少弱精子症患者的精液量、精子浓度、活动力，同时可提高精浆超氧化物歧化酶活性，降低精浆丙二醛含量，表明补肾活血方改善精子质量可能与其抗氧化作用有关[6]。为进一步探究补肾活血方对精索静脉曲张导致生精功能损伤的疗效机制，本研究通过建立精索静脉曲张大鼠模型，观察补肾活血方对模型大鼠精子参数、睾丸组织病理学、生精细胞凋亡及睾丸组织NO含量的影响，探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠40只，3月龄，体质量150～200 g，购自第四军医大学实验动物中心，动物许可证号SYXK2012（陕）2012-006；动物分笼饲养在普通级动物房，温度20～22 ℃、相对湿度50%～70%，明暗周期12 h/12 h，自由摄食饮水。

1.2 药物及制备

补肾活血方（淫羊藿20 g，熟地黄10 g，当归15 g，紫河车10 g，黄精10 g，黄芪15 g，制水蛭10 g，沙苑子10 g，煅牡蛎20 g，荔枝核10 g，王不留行20 g），饮片由陕西省中医医院中药房提供，用时将中药常规煎煮，过滤，浓缩，4 ℃冰箱保存备用。灌胃时配制相应浓度混悬液。

1.3 主要试剂与仪器

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，货号MK1020），NO测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号A012-1-2）。电子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司，型号AL104）；高速低温离心机（美国赛默飞世尔科技公司，型号Thermo Fresco17），图像分析系统（成都泰盟软件有限公司，型号BI-2000），光学显微镜（上海尼康仪器胡限公司，型号E200）。

1.4 造模、分组及给药

参照文献[7]方法造模，部分结扎左肾静脉及左肾总静脉之间交通支。假手术组只行左肾静脉分离而不结扎。术后大鼠肌注青霉素钠，20万U/d，连续3 d，预防感染。喂食标准饲料，继续饲养48 d。术后48 d，所有大鼠剖腹观察，用游标卡尺测量左侧精索静脉直径，观察其曲张程度。如大鼠左侧精索内静脉直径比假手术组扩张2倍且双肾大小无明显差异，左肾无缺血萎缩等明显病变，表明造模成功[8]；假手术组精索静脉无扩张增粗。将造模成功大鼠随机分为模型组和补肾活血方低、中、高剂量组，每组8只。假手术组和模型组给予10 mL/kg双蒸水灌胃；中药给药剂量按人和大鼠体表面积换算成临床成人用量的3、6、12倍，即补肾活血方低、中、高剂量组分别为6.3、12.6、25.2 g/kg，给予相应剂量混悬液灌胃，给药体积均为10 mL/kg。每日1次，连续60 d。末次给药1 h后称重。水合氯醛腹腔注射麻醉，摘除左侧睾丸、附睾，称重。之后取每只大鼠左侧睾丸，一半用于睾丸组织病理分析、生精细胞凋亡检测，另一半睾丸组织冰上匀浆，用于NO含量测定。

1.5 精子浓度和活动率检测

迅速取左侧附睾，剪碎，溶于2 mL生理盐水，37 ℃继续孵育15 min至精子完全游出，以获得精子悬液。取精子悬液混匀，滴到血细胞计数板上，进行精子浓度、活动率检测。

1.6 睾丸组织学分析

睾丸组织常规固定，24 h后脱水，石蜡包埋，切片（厚度约3 μm），HE染色，光镜下观察睾丸生精小管形态、精子发生状态和睾丸组织形态。

1.7 睾丸生精细胞凋亡检测

TUNEL法检测睾丸组织生精细胞凋亡。按TUNEL检测试剂盒说明书进行操作。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。将组织切片置于400倍光镜下观察，每张切片随机选择5个视野，计数500个细胞，进行阳性细胞计数，取平均值，求得阳性细胞率即为凋亡指数。

1.8 睾丸组织匀浆一氧化氮含量测定

睾丸组织冰上匀浆，测定NO含量，按试剂盒说明书进行操作。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 补肾活血方对精索静脉曲张模型大鼠睾丸、附睾质量及脏器指数的影响

与假手术组比较，模型组大鼠睾丸、附睾质量及脏器指数均明显降低，差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01）；与模型组比较，补肾活血方低、中剂量组大鼠睾丸、附睾质量及脏器指数显著增加，差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01）。结果见表1。

表1 各组大鼠睾丸、附睾质量及脏器指数比较（±s）

注：与假手术组比较，*＜0.05，**＜0.01；与模型组比较，#＜0.05，##＜0.01

2.2 补肾活血方对精索静脉曲张模型大鼠精子浓度及活动率的影响

与假手术组比较，模型组大鼠精子浓度、活动率显著降低（＜0.01）；与模型组比较，补肾活血方中、高剂量组大鼠精子浓度、活动率明显增加（＜0.05，＜0.01）。结果见表2。

表2 各组大鼠精子浓度和活动率比较（±s）

注：与假手术组比较，**＜0.01；与模型组比较，#＜0.05，##＜0.01

2.3 补肾活血方对精索静脉曲张模型大鼠睾丸组织损伤的影响

假手术组大鼠生精小管饱满，小管内生精上皮层数完整，各级生精细胞排列整齐有序，管腔内可见大量成形的精子细胞；模型组大鼠生精小管内生精上皮明显变薄，且可见到大量生精细胞的缺失，管腔内几乎无成熟的精子细胞；补肾活血方低剂量组生精上皮仍薄，且有生精细胞缺失，但管腔中可见成熟的精子细胞；补肾活血方中、高剂量组小鼠生精上皮层数增加，各级生精细胞排列规律，管腔中可见大量的成熟精子细胞。结果见图1。

2.4 补肾活血方对精索静脉曲张模型大鼠睾丸生精细胞凋亡的影响

与假手术组比较，模型组大鼠睾丸生精细胞凋亡明显增多；与模型组比较，补肾活血方低、中、高剂量组大鼠睾丸生精细胞凋亡显著减少，见图2。模型组大鼠睾丸生精细胞凋亡指数较假手术组显著增加（＜0.01），补肾活血方低、中、高剂量组较模型组大鼠睾丸生精细胞凋亡指数显著降低（＜0.01），见表3。

图1 各组大鼠睾丸组织形态（HE染色，×200）

注：棕色细胞为凋亡的生精细胞

表3 各组大鼠睾丸生精细胞凋亡指数比较（±s，%）

注：与假手术组比较，**＜0.01；与模型组比较，##＜0.01

2.5 补肾活血方对精索静脉曲张模型大鼠睾丸组织一氧化氮含量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠睾丸组织NO含量显著增加，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，补肾活血方低、中、高剂量组大鼠睾丸组织NO含量明显降低，差异有统计学意义（＜0.01）。结果见表4。

表4 各组大鼠睾丸组织NO含量比较（±s，mg/mL）

注：与假手术组比较，**＜0.01；与模型组比较，##＜0.01

3 讨论

目前，关于精索静脉曲张致男性不育的机制可能与睾丸微循环障碍、睾丸局部温度增高、缺氧、氧自由基增多及细胞凋亡等多种途径共同作用有关[9]。其中睾丸生精细胞凋亡是精索静脉曲张致不育的重要机制之一。正常精子发生过程中，生精细胞增殖和凋亡维持相对平衡。在生理情况下，哺乳动物精子发生过程中存在不同阶段生殖细胞凋亡，可消除异常的生精细胞，维持支持细胞和生精细胞比例，从而确保精子的质量和数量。精索静脉曲张时如低氧、氧化应激、阴囊局部温度升高、免疫作用、肾脏及肾上腺毒性物质返流等均可致生精细胞凋亡[10]。生精细胞凋亡增加可导致少精或弱精症，引起男性生殖力下降或不育。

精索静脉曲张性不育属中医学“筋瘤”“精瘀”“不育”范畴，目前大多医家认为“肾虚血瘀”是精索静脉曲张性不育的主要病机，补肾活血法为主要治法，且临床疗效显著[11-14]。补肾活血方以“补肾填精、养血活血”为大法组方，方中淫羊藿温肾助阳，熟地黄滋补肾阴、填精益髓，两者合用补肾填精、补阴益阳，共为君药。黄精益气健脾补肾，先后天之精同补，紫河车系血肉有情之品，能补肾益精、养血益气，沙苑子、煅牡蛎与黄芪共用补气固精，有助于恢复“肾藏精”的功能，当归养血活血，取精血同源、养血填精之功，水蛭专走血分，破血化瘀，散瘀通络，共为臣药。荔枝核、王不留行行气活血，气行则血行，改变久病络脉气血瘀滞的状态，共为佐药。诸药合用，共奏补肾填精、养血活血之功。现代药理研究发现，补肾活血方中主要药物具有抗凋亡的作用。淫羊藿中主要成分淫羊藿苷和淫羊藿总黄酮对生精细胞凋亡有明显调控作用[15-16]。当归多糖、黄芪多糖及其配伍对化疗性骨髓抑制小鼠骨髓干细胞能促进Bcl-2 mRNA表达、降低Bax、Caspase-9 mRNA表达，抑制细胞凋亡[17]。黄精多糖可抑制长春新碱对骨髓基质细胞生长的抑制及凋亡作用[18]。荔枝核总黄酮可上调Bcl-2、下调Bax的表达，抑制肝细胞凋亡，发挥抗肝纤维化的作用[19]。沙苑子黄酮可减轻内质网应激诱导的细胞凋亡，保护百草枯所致的肺损伤[20]。牡蛎提取液对高温所致神经干细胞的凋亡具有一定的保护作用[21]。

本实验研究发现，模型组大鼠精子浓度、活动率较假手术组明显降低，睾丸组织病理学显示生精小管内生精上皮明显变薄，可见大量生精细胞缺失，管腔内成熟精子细胞较少，表明精索静脉曲张性生精障碍模型建立成功。经补肾活血方干预后，中、高剂量组模型大鼠精子浓度、活动率明显升高，睾丸组织病理损伤明显改善，且随着药物剂量的增加，恢复趋势更为明显，表明补肾活血方可改善精索静脉曲张模型大鼠生精损伤，减少睾丸组织病理损伤。本实验采用TUNEL法检测生精细胞凋亡，结果显示模型组生精细胞凋亡指数较假手术组显著增加；而补肾活血方组较模型组生精细胞凋亡显著减少，中剂量组最显著，表明补肾活血方可通过抑制精索静脉曲张模型大鼠的生精细胞凋亡改善生精损伤。

近年来，NO为研究较多的精索静脉曲张致男性不育的一种效应分子。精索静脉曲张时，精索静脉血液淤积，以及返流的代谢产物刺激血管内皮细胞、巨噬细胞和睾丸细胞产生过量的一氧化氮合酶（NOS），加之精索静脉血中L-精氨酸含量升高，多因素促使NO生成增加[22]。研究表明，NO对精子有双重影响：低水平NO可维持正常生精、灭活超氧阴离子、提高精子活动度；然而，NO浓度过高会让机体内诱导型NOS过度表达，进而对线粒体呼吸链中的酶起到抑制作用，损害正常细胞，从而使生精细胞数量减少，降低精子获能和顶体反应率，抑制精子的活动度，导致生育力下降[23]。因此，调节NO过度生成是治疗精索静脉曲张性男性不育的重要方式。研究表明，补肾活血方药物中的多糖如熟地多糖、当归多糖、黄精多糖等均有显著抗氧化作用，可通过提高抗氧化酶的活性，清除过量自由基的产生，调节NO体系的平衡，减轻NO产生伴随的细胞毒性作用[24-25]。本实验中模型大鼠睾丸组织NO含量明显高于假手术组，而补肾活血方各剂量组大鼠睾丸NO含量较模型组明显减少，且随着药物剂量的增加更为明显，表明补肾活血方可通过降低NO水平减少其对精索静脉曲张模型大鼠睾丸的毒性损伤，从而改善其生精功能。

综上，补肾活血方可通过改善精索静脉曲张大鼠精液参数，睾丸、附睾脏器指数，睾丸组织病理损伤，降低其生精功能损伤，其机制可能与抑制生精细胞凋亡、减少NO造成的睾丸毒性损伤有关。

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Effects ofPrescription on Spermatogenesis in Varicocele Model Rats

LIU Jianguo1,2, ZHAO Hongle1, LI Jiaojiao2, MA Yaling2, ZHAO Yutao2

To study the effects ofPrescription on spermatogenic of experimental varicocele model rats; To discuss its mechanism.8 out of 40 male SD rats were randomly selected as sham-operation group, and the rest rats were ligated with left renal vein to create the pathological model of varicocele. After the model was established successfully, they were randomly divided into the model group,Prescription low-, medium- and high-dosage groups, with 8 rats in each group. 48 days after establishing the model, medicine was given continuously for 60 days. At the end of the treatment, the left testis and epididymis of rats were removed; the weight of testis and epididymis, organ index, sperm concentration and activity rate were measured; pathological changes of testis were observed by HE staining; spermatogenic cell apoptosis was detected by TUNEL; NO level of testicular tissue was detected by homogenization.Compared with the sham-operation group, the weight of testis and epididymis and organ index, sperm density and vitality were significantly reduced; the seminiferous epithelium of testis was obviously thinner; a large number of seminiferous cells were missing; there were almost no mature sperm cells in the lumen; the spermatogenic cells apoptosis index and the concentration of NO in testicular tissue significantly increased. Compared with the model group, the weight of testis and epididymis and organ index, sperm density and vitality increased significantly; the injury of testicular tissue recovered obviously; the spermatogenic cell apoptosis index and NO concentration decreased significantly inPrescription groups.Prescription can improve the spermatogenesis of varicocele model rats, and the mechanism may be related to inhibiting spermatogenic cell apoptosis and reducing the toxic damage of NO to testicular tissue.

Prescription; varicocele; spermatogenesis; apoptosis; NO; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)10-0054-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202003639

国家自然科学基金（81603631）；陕西省自然科学基金（2016JQ8034）；陕西省中医药管理局项目（2015-JC012）

赵红乐，E-mail：zhaohongle1988@163.com

（2020-03-24）

（2020-04-08；编辑：华强）