CO2激光犬声带全切除后不同时间细胞外基质表达△

汪斌如 张莹莹 杨丽萍 刘莉 陈始明 梁耕田

声带固有层主要由细胞外基质(extracellular matrix, ECM)组成，其组织结构决定了声带的振动特性和粘膜波功能，是正常发声的基础[1，2]。正常情况下，ECM的合成和降解处于动态平衡，以维持声带的发声功能；在手术、感染、外伤等病理情况下，ECM的动态平衡受到破坏，就会出现声带瘢痕而引起永久性声嘶甚至失声[3，4]。目前有关声带损伤后ECM中相关因子表达致声带瘢痕的具体发病机制尚不清楚，其可能是声带瘢痕形成和难以治愈的原因之一[2～4]。前期研究显示，犬声带损伤后12 w时声带固有层ECM胶原纤维过度无序增生和弹性纤维减少，出现了声带瘢痕[5]。赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase, LOX)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)在ECM的合成和伤口愈合中发挥重要作用[6～8]，其中，LOX参与ECM胶原蛋白和弹性蛋白的翻译后修饰过程，MMPs参与ECM各种蛋白的降解、血管形成，MMPs的异常表达是组织损伤后不能自我修复的重要原因；HIF-1α参与了组织损伤后的蛋白合成和微血管形成等过程。有关研究显示，调节LOX基因和MMP基因的表达对韧带和心肌损伤修复具有重要的影响[9～11]。目前有关LOX、MMPs和HIF-1α在声带修复中的研究较少，推测LOX、MMP-1可能在声带损伤后创面自身愈合及瘢痕形成中发挥着不同的作用。故本研究拟采用CO2激光切除犬双侧声带，观察术前和术后不同时间段声带形态学、ECM中LOX、MMP-1和HIF-1α在声带创面愈合过程中的动态表达特点，探讨声带损伤后的修复机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 5只健康成年雄性中华田园犬(湖北省瑞科森试验动物有限公司提供，体重12～15 kg)，数字表法随机分为实验组(4只，8侧声带)和对照组(1只，2侧声带)。实验组分别行支撑喉镜下CO2激光双侧声带切除术，于术后6 h、3 w、8 w和12 w分别处死1只犬于声带取材，对照组不做特殊处理。所有实验操作均符合武汉市第三医院动物伦理委员会要求。

1.2主要器材及试剂 Lumenis型贝多芬智能CO2激光(美国科医人)，IX51型倒置显微镜和CX-21型普通光学显微镜(日本OLYMPUS)，显微喉钳、支撑喉镜、高清喉内窥镜及视频记录系统、冷光源、0°内窥镜镜头(德国karl Storz)，anti-LOX抗体，anti-MMP-1抗体和anti-HIF-1α抗体(北京Bioss)。

1.3CO2激光犬声带全切除术 实验组动物术前禁食12 h，称重，左后肢肌肉注射麻醉(速眠新0.1 mg/kg+戊巴比妥钠0.8 mg/kg)，在支撑喉镜下暴露双侧声带，应用CO2激光6焦耳/秒行双侧声带全切除深达肌层，清除创面碳化组织，充分止血。术后软食，1 w后改正常饮食。对照组在支撑喉镜下观察声带形态后不作任何处理，清醒后正常进食。

1.4犬声带形态学观察 对照组和实验组犬分别于术前及术后6 h、3 w、8 w和12 w肌肉注射麻醉(方法同上)后，于支撑喉镜下观察声带创面愈合情况，并于各时间点取一只犬实施安乐死，双侧声带多点取材进行HE染色和免疫荧光染色检查。

1.5HE染色 声带标本用4%甲醛固定，石蜡包埋切片，片厚4 μm，HE染色。光学显微镜下观察声带各层炎症反应、纤维结构变化以及瘢痕形成情况。

1.6免疫荧光染色 声带标本石蜡切片，烘片脱蜡。PBS冲洗3次。EDTA缓冲液微波修复。PBS洗3次各5 min，甩干，5% BSA封闭20 min。去除BSA液，每张切片加50 μl一抗，覆盖组织，4 ℃过夜。PBS洗三次，各5 min，加二抗，37 ℃孵育50 min；PBS 洗三次，各5 min；防淬灭剂封片。每个标本随机取1张切片，每张片任选2～3个视野，视野面积为0.51 mm×0.40 mm。荧光显微镜下观察声带LOX、MMP-1和HIF-1α蛋白表达部位和量，以及声带瘢痕的形成情况。高倍镜(×400)下取3个不重叠视野，矫正光密度后对各组图像选色，采用Image-Pro Plus 6.0软件分析系统测量图像共定位区域累积光密度值(integrated optical density index, IOD值)，反映共定位区域面积和荧光强度。

1.7统计学方法 以IBM SPSS Statistics 22.0行统计学分析，图像采集的IOD值用均数±标准差表示。各组数据呈正态分布并经方差齐性检验后，多组间比较用One-Way ANOVA中的LSD或Dunnett检验，采用Pearson进行相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1对照组及实验组犬声带形态学观察结果 支撑喉镜下犬正常声带表面呈白色,可见血管纹,粘膜光滑，声门闭合及发音功能良好(图1a)；CO2激光切除犬双侧声带至肌层(图1b，术后6 h)；术后3 w声带创面见较明显的充血水肿及炎性分泌物(图1c)；术后8 w双侧声带充血水肿试验,声带局部凹陷(图1d)；术后12 w双侧声带充血水肿消失，表面光滑，无粘连和肉芽，声带局部挛缩，双侧声带闭合不全，声嘶明显(图1e)。

2.2犬声带组织HE染色结果 术前声带分层清晰，由被覆复层鳞状上皮层、结缔组织层、肌层构成(图2a)；术后6 h，声带创面大量红细胞和炎性细胞浸润，细胞充血水肿明显(图2b)；术后3 w，声带创面上皮下固有层仍有炎症细胞浸润，新生微血管形成，成纤维细胞增生，无序排列，间质水肿(图2c)；术后8 w，声带创面炎性细胞浸润减少，无明显红细胞渗出，血管增粗，各层纤维组织增生，呈束状或团状紊乱排列(图2d)；术后12 w，声带上皮层大部分缺失，复层鳞状上皮细胞层数增多；固有层血管或腺体减少或消失，腺体内有黏蛋白积聚；固有层胶原纤维增厚、增多，纤维组织团状或束状紊乱排列，较多不规则纤维裂隙；肌层可见散在紊乱的胶原纤维束(图2e)。

2.3免疫荧光染色结果

2.3.1ECM相关因子阳性细胞表达 由图3可见，LOX、MMP-1和HIF-1α均定位于细胞核和细胞浆，术前(对照组)和术后(实验组)声带均呈程度不一的阳性反应。术前阳性细胞主要位于固有层全层，浅层含量略多。术后6 h和3 w，双侧声带创面上皮细胞和纤维层的炎性细胞、血管内皮细胞和腺体内阳性细胞表达较强烈；术后8 w和12 w，双侧声带创面阳性细胞逐渐减少，恢复至术前水平。

2.3.2IOD值分析 术前及术后6 h、3 w、8 w和12 w各因子IOD值见表1，可见各时间点LOX、MMP-1比较差异有统计学意义(P<0.05)；除术后12 w与术前比较外，其余各时间点HIF-1α比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各相关因子在犬声带损伤不同时间段免疫荧光IOD值比较

3 讨论

徐文等[12]报道声带损伤后3个月声带瘢痕基本形成。本研究实验组犬CO2激光声带全切除后支撑喉镜下显示，CO2激光手术创面位于双侧声带，深达肌层，术后3 w，声带创面仍有充血水肿，术后8 w声带创面充血水肿减轻，表面凹陷，术后12 w声带创面不规则瘢痕基本形成。组织学观察显示声带损伤早期(术后3 w)，创面较多炎性渗出，间质充血水肿，新生血管形成；损伤中期(术后8 w)，创面炎症反应明显减少，纤维组织增生明显；损伤后期(术后12 w)，创面纤维组织大量增生，呈团状或束状排列紊乱，较多不规则间隙，排列结构紊乱，提示声带瘢痕形成。

LOX促进ECM胶原和弹性蛋白的翻译后修饰过程，同时维持ECM内环境免受金属蛋白酶的降解，在ECM的生长、重塑、稳定和伤口愈合中发挥重要作用[5,6]；LOX过表达时，引起ECM的过度交联，引发不可逆的渐进性的组织纤维化。MMPs是胶原和弹性纤维降解的主要蛋白酶，参与ECM的降解、促进新生血管的形成、调节细胞间粘附等；MMP-1由成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞等多种细胞分泌，主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅹ型胶原并促进新生血管形成[7,10]。本研究结果显示，LOX、MMP-1和HIF-1α定位于细胞浆和细胞核，大多在炎性细胞，血管内皮细胞和腺体内表达较强烈。声带损伤早期(术后6 h)LOX表达稍有下降，此后其合成不断增加，损伤中后期(术后3～12 w)时仍维持较高水平；MMP-1在声带损伤早期(术后6 h)表达较术前下降，声带损伤中期(术后3 w)升高达最高值，至声带损伤后期(术后12 w)达较低水平，这与部分学者报道前交叉韧带损伤后成纤维细胞中LOX基因表达上升、MMP-1主要基因表达下降的结果一致[11，13]。即MMP-1主要在声带瘢痕形成早期发挥作用，而LOX主要在声带瘢痕形成中后期发挥作用，但MMP-1在声带瘢痕形成全程中的表达量明显少于LOX，不足以对抗LOX的纤维化作用。低氧环境是瘢痕形成的重要因素，声带创伤早期，组织缺氧会影响成纤维细胞的活性，胶原的合成与降解、生长因子的分泌。HIF-1α是缺氧的特异感受因子，通过协助蛋白合成、血管再生促进创面愈合。文中结果显示，声带损伤早期(术后6 h)，HIF-1α迅速增加至峰值，中后期(术后3～12 w)逐渐恢复至正常水平；HIF-1α在术后12 w和术前相比未见明显统计学差异，说明HIF-1α主要在声带损伤早中期(8 w内)发挥作用。需要指出的是，由于IOD值仅间接反映阳性目标总的表达强度，加之本研究观察标本数量较少，损伤的程度和个体愈合的机制可能有所不同[14]，这些因素均可能导致上述结果存在一定的误差。

较多学者认为声带术后15 d内处于极度活跃增生状态，3个月后瘢痕组织趋于稳定[1,15]。文中结果显示术后6 h、3 w和8 w LOX、MMP-1和HIF-1α表达差异有统计学意义，即LOX、MMP-1和HIF-1α在术后早中期(<8 w)表达较活跃，至术后12 w时随着创面基本愈合其表达也趋于稳定。LOX、MMP-1在术前和术后不同时间段表达有统计学差异，尤其是术后12 w时仍未回复至术前水平，说明术后12 w时LOX、MMP-1仍处于较高表达状态，声带瘢痕仍未完全稳定，也间接证实了部分学者报道的声带损伤后6～12个月时声带瘢痕中纤维蛋白表达量较术前仍有增加[12,16]。

综上所述，正常声带ECM中LOX、MMP-1和HIF-1α的表达很低，在创伤时，声带组织发生应激反应，由成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞合成的MMP-1增加，促进ECM中各种胶原降解、细胞黏附[5,7]，HIF-1α等物质合成增加也会直接或间接参与微血管形成[8]。但由于MMP-1和HIF-1α在声带损伤早中期表达量较少，发挥的作用有限，对声带瘢痕的预防和治疗效果尚不明显。在声带损伤中后期，LOX过度表达，参与ECM纤维蛋白的翻译后修饰过程，导致大量的胶原纤维过度分泌和无序沉积，以及弹性纤维减少，促进了声带瘢痕形成[9，14，17]。故探讨靶向促进MMP-1和HIF-1α的表达，同时靶向抑制LOX的合成，可能为声带瘢痕的防治提供新的研究思路[9～11]。