淫羊藿素调控NF-κB信号活性干预心肌缺血再灌注损伤大鼠的初步研究

陈浩，吴彬，袁萍，张飞虎，王晚萍，黄志华，黎晓

（1.赣南医学院2017级本科生；2.赣南医学院2018级本科生；3.赣南医学院基础医学院，江西赣州341000）

缺血器官在恢复血流灌注后加重细胞损伤的现象，称为缺血再灌注损伤［1］（ischemia reperfusion injury，IRI）。心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是当前引发心血管疾病的主要原因之一［2］。目前溶栓治疗仍是临床上针对心肌梗塞患者采取的最有效的措施之一，但容易诱导心肌缺血再灌注损伤的发生［3］，引起各种心血管不良反应甚至心脏骤停［4］。据文献报道，现有药理干预手段多针对心肌缺血再灌注损伤后所诱导的氧化应激机理进行［5-6］，但MIRI机制非常复杂，因而继续寻找更多安全有效且多靶点作用机理的药物意义非凡［7］。淫羊藿素（Icaritin，ICT）是植物雌激素类化合物淫羊藿苷的代谢产物，具有类雌激素样作用［8］。我们的前期研究发现，ICT对缺血再灌注损伤心肌组织有一定疗效，并且发现ICT浓度为1 mg·kg-1时治疗效果最佳，其作用机制可能与抑制氧化应激炎症级联反应有关［9］，但其具体作用靶点仍有待进一步探讨。为此，本研究拟探讨ICT对缺血再灌注损伤心肌的保护作用是否通过调控NF-κB信号分子活性，进而抑制炎症反应的发生。

1 材料

1.1 实验动物2个月SD大鼠，雄性，体重220～240 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司［动物使用许可证号：SYXK（赣）20180004，动物合格证号：43004700048216，级别：SPF级］，所有使用的动物均于项目申报时经赣南医学院医学伦理委员会审核，符合国家科技部国科发财字〔2006〕398号文件《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。

1.2 药物和试剂淫羊藿素（C21H20O6），分子量为368.38，纯度≥99%，呈黄色粉末状，由上海天习化工有限公司提供，用时加二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解（货号：T887725G，Sigma公司）；P65抗体（货号：3033S，Cell signaling Technology公司）及其磷酸化抗体（货号：4764S，Cell signaling Technology公司）；IL-1β（货号：ab9787，Abcam公司）和IL-6抗体（货号：ab9324，Abcam公司）；GAPDH抗体（货号：2118S，Cell signaling Technology公司）；山羊抗兔IgG（货号：31460）、山羊抗鼠IgG（货号：31430）等二抗及PVDF膜（货号：88518）、蛋白定量试剂（货号：A33972）、增强化学发光试剂（货号：34580）等均为Thermo fisher公司产品。反转录试剂盒（货号：C28025，Invitrogen公司）；SYBR®Select Master Mix：Life techno logier（货号：4472908）；引物由广州易锦生物技术有限公司合成。

2 方法

2.1 实验分组与给药实验设假手术组、模型组、ICT治疗组（1 mg·kg-1），每组8只；ICT治疗组按剂量经腹腔注射给药，假手术组和模型组给予同体积的DMSO腹腔注射。由于实验操作的原因后续用于实验的大鼠为假手术组5只、模型组6～7只、ICT治疗组6～7只。

2.2 MIRI大鼠模型的制备大鼠经腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，仰卧固定于鼠板上，术中进行呼吸及心电连续监护。MIRI手术方法：大鼠颈部皮肤常规消毒清理，用手术刀作皮肤正中切口，钝性分离皮下各层结缔组织，暴露气管后，行气管插管术，连接动物呼吸机监控呼吸，待正常后（潮气量4 mL·100 kg-1，呼吸频率60次/min，呼吸比1.2∶1），沿胸骨左缘约0.5 cm处剪断第3～4肋骨，打开胸腔，露出心脏，剪开心包；仔细观察左前降支冠状动脉（LAD）走行后，用6/0丝线无创缝合针经LAD起始部位约2 mm处穿过，并连同栓线共同结扎。观察心电图，出现ST段上抬，且结扎部位出现肉眼可见的暗紫色以及心尖部颜色变苍白，表明缺血成功；缺血45 min后轻轻拔出栓线再复灌60 min，进一步观察缺血部位，心肌变红润、ST段出现回落则表明再灌注成功，结扎失败或再灌注失败的大鼠不用于后续实验。假手术组仅对其穿针不进行结扎，其他操作与模型组相同，ICT治疗组于结扎后即行给药。

2.3 Real time-PCR方 法 检 测NF-κB、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平再灌注结束后，取大鼠心脏缺血半暗带区制备组织匀浆，按照Trizol试剂盒使用说明提取心肌组织的总RNA，之后参照说明书进行逆转录。引物序列参见表1。反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性10 s，迅速冷却至61℃退火20 s，快速升温至72℃延伸25 s，共40个循环。

表1引物序列

2.4 Western blot检测NF-κB（p65）、IL-6和IL-1β的蛋白表达水平心肌组织加入细胞裂解液充分裂解后，4℃离心，12 000 g×5 min，BCA方法进行蛋白定量，取20μg总蛋白加入上样缓冲液煮沸变性，经SDS/PAGE凝胶电泳，然后电转移至PVDF膜，封闭后，一抗4℃过夜，二抗室温孵育1 h，增强化学发光试剂孵育1 min后，化学发光免疫定量分析系统进行照相及灰度分析。

2.5 统计学方法选用Prism7.0统计软件分析数据。计量资料用-x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 ICT抑制MIRI大鼠炎症反应的作用根据前期研究结果，ICT能降低MIRI大鼠心肌组织中IL-1β的mRNA水平（P＜0.05），同时降低血清中IL-1β的含量（P＜0.05）。提示ICT可能可以抑制MIRI诱导的炎症反应，进一步应用Real time-PCR方法检测各组大鼠IL-6、TNF-α和IL-1β等炎症因子的mRNA水平，结果如图1所示：相比于假手术组，Vehicle组IL-6、TNF-α的mRNA水平明显升高（其中IL-6 mRNAP＜0.05；TNF-αmRNAP=0.0531，可能受样本数量影响），ICT治疗后则显著降低。

进一步应用Western blot方法检测各组大鼠心肌组织中IL-6、IL-1β的蛋白表达水平加以验证，结果如图2所示：相比于假手术组，Vehicle组IL-6、IL-1β的蛋白表达水平明显升高，ICT治疗后可逆转其蛋白表达量，差异有统计学意义，且与mRNA表达趋势一致，提示ICT的确能有效抑制MIRI所诱导的炎症反应。

图1 ICT抑制MIRI大鼠心肌组织中IL-6、TNF-α的mRNA表达水平

3.2 ICT抑制MIRI大鼠炎症反应的作用路径NF-κB是细胞内重要的核转录因子，参与了机体的炎症反应、免疫应答等过程，是最经典的炎症信号分子［10］。NF-κB家 族 有5个成 员，包 括NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）、RelA（p65）、RelB和c-Rel，通常所说的NF-κB蛋白，是指p65/p50亚单位所形成的二聚体蛋白。因此，我们检测了各组大鼠心肌组织中NF-κB的mRNA表达水平及p-P65/P65的蛋白表达情况。结果如图3所示：相比于Sham组，Vehicle组 中NF-κB mRNA表 达 水 平 上 升（P＜0.05）、p-P65/P65蛋白比值升高（P＜0.01）；相比于vehicle组，ICT治疗后NF-κB mRNA水平降低（P＜0.05）、p-P65/P65蛋白比值下降（P＜0.05），差异均有统计学意义。

4 讨论

图2 ICT抑制MIRI大鼠心肌组织中IL-6和IL-1β的蛋白表达水平

图3 ICT抑制MIRI大鼠心肌组织NF-κB表达水平

缺血区炎症反应的主要表现是炎性细胞的活化，并释放IL-1β、TNF-α、IL-6等大量炎性因子［11］。缺血心肌再灌注过程能够诱导NF-κB的活化，活化的NF-κB可进入细胞核并作用于特定的DNA靶序列，对IL-1、IL-6、TNF-α及IL-8等炎性因子的释放进行转录调节［12］，因而可促发炎症反应并加重心肌组织损伤。说明调控NF-κB是缓解MIRI大鼠炎症反应的重要手段［13］，曾先燕，WEI QUAN等也证实了这一点［14-15］。本研究中，我们运用淫羊藿素干预了缺血再灌注损伤大鼠，结果发现，淫羊藿素能有效抑制MIRI大鼠心肌组织中炎症因子的表达，并降低NF-κB的mRNA及P65蛋白表达水平，提示淫羊藿素可能通过抑制NF-κB信号分子的活化，进而抑制炎症因子的释放，从而减轻MIRI大鼠的心肌损伤。此外，郑勇等研究发现，淫羊藿苷在肠道代谢后的主要产物之一——淫羊藿次苷Ⅱ，能通过调节NF-κB信号通路抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞的炎症反应［16］，而淫羊藿素也是淫羊藿苷的代谢产物之一［17］，进一步提示，NF-κB信号分子可能是淫羊藿素作用的重要靶点。

然而，NF-κB信号的激活形式多样，主要通过以下三种通路激活：经典通路、旁路通路和非典型通路，其中NF-κB1、RelA、c-Rel均由经典通路激活，而NF-κB2、RelB由旁路通路激活，对于DNA氧化损伤等所激活的则主要是非典型通路；此外，P65作为NF-κB蛋白的重要组分，其进行翻译修饰后，也可改变NF-κB的活性［18］，这些证据表明，NF-κB活性的调节机制复杂，其作为淫羊藿素治疗和预防MIRI作用中的干预靶点，仍需进一步深入研究。