超高效液相色谱-串联质谱法测定鲜鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留

吉小凤，吕文涛，汪建妹，廖琳慧，徐 杰，钱鸣蓉，*

(1.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州310021; 2.丽水市莲都区农业技术推广中心， 浙江 莲都 323000)

民以食为天，食以安为先。食品是人类赖以生存和发展的基本物质，也是人们生活中最基本的必需品。近年来，人们越来越关注杀虫剂和其他化学物质可能会改变人类和野生动物正常的内分泌功能。内分泌干扰物可引起多种不良反应包括发育、生殖和行为危害等[1]。众所周知，杀虫剂对啮齿动物和哺乳动物，包括人类具有神经毒性[2]。

氟虫腈属于苯基吡唑类杀虫剂，主要作用是通过与α-氨基丁酸受体结合，抑制氯离子通道，破坏中枢神经系统从而杀灭昆虫[3-5]。氟虫腈杀虫谱广，可适用于水稻、玉米、棉花及其他广泛经济作物的虫害防治中，同时还适用于非农业领域杀虫，如可杀灭跳蚤、螨和虱[6-9]。氟虫腈是一种化学性质活泼的化合物，在施用后，经过水解、光解等作用，会生成3种代谢产物氟虫腈砜、氟虫腈硫醚和氟甲腈[6]。而经过对代谢物毒性的研究，这三者的毒性要高于氟虫腈原药[7]。

世界各国已对鸡蛋中氟虫腈的残留量制定了最大残留限量标准(MRL)，其中，国际食品法典(CAC)和日本食品安全标准中规定，氟虫腈在蛋中的最大残留限量为20 μg·kg-1[8]。美国相关标准规定，氟虫腈在蛋中的最大残留限量为30 μg·kg-1[8]。欧盟相关标准规定，氟虫腈在蛋中的最大残留限量为5 μg·kg-1[8]。在保护环境和食品安全的大背景下，我国农业部于2009年发布公告停止生产销售氟虫腈农药[9]，我国GB 2763—2019规定鸡蛋中其最大残留限量为20 μg·kg-1。

我国是鸡蛋生产大国，据统计，2013年我国禽蛋生产量达到2 876万t，人均占有量约为21 kg[10]。鲜鸡蛋已渐渐成为人们每日餐桌上不可或缺的食材。欧洲“毒鸡蛋”事件使得鲜鸡蛋的食品安全引发消费者的关注。为了更好地了解市场上鲜鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留状况，本文通过建立优化的QuEChERS前处理方法结合高效液相色谱-串联质谱法开展鲜鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留状况分析，为鲜鸡蛋质量安全科学监管提供基础数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氟虫腈、氟虫腈砜、 氟虫腈硫醚标准品(纯度均大于98%，Dr.Ehrenstorfer， GmbH)；氟甲腈 (100 mg·L-1，农业农村部环境科研监测所)；乙腈(HPLC级，德国Merck公司)；甲醇(HPLC级，德国Merck公司)；甲酸(HPLC级，美国ANAQUA公司)；甲酸铵(HPLC级，北京飞美斯分析科技有限公司)；无水硫酸钠、氯化钠(分析级，中国凌峰化工试剂有限公司)；QuEChERS分散试剂盒含50 mg PSA，50 mg C18，150 mg无水硫酸镁(美国Agilent公司)；实验用水为Milli-Q纯水仪制备的超纯水(≥18 MΩ·cm)。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪(UPLC，日本岛津公司)；QTRAP®6500三重四级杆-线性离子阱复合质谱仪(美国AB Sciex公司)；BS2202S电子天平(德国Sartorius公司)；SORVALL® Heraeus Biofuge冷冻高速离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Talboys数显涡旋混合仪(美国Troemner公司)；超纯水仪(美国Milli-Q公司)；KQ-100超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.3 仪器测定条件

ACQUITY UPLC C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱温40 ℃；进样体积为5 μL；流动相A为甲醇，流动相B为含0.1% 甲酸和2 mmol·L-1甲酸铵的水溶液；流速为0.20 mL·min-1；梯度洗脱程序：0～1 min，90%～10% B；1～4 min，10% B；4～4.1 min，10%～90% B；4.1～7 min，90% B。

离子源为电喷雾离子源(ESI)；检测方式为多反应监测(MRM)；扫描方式为负离子扫描；喷雾电压(IS)：-4 500 V；离子源温度(TEM)500 ℃；气帘气(CUR)压力275.80 kPa；雾化气(GS1)压力379.23 kPa；辅助气(GS2)压力344.75 kPa；目标化合物多反应监测参数见表1。

表1 氟虫腈及其代谢物质谱参数Table 1 Spectrum parameters of fipronil and its metabolites

1.4 方法与步骤

1.4.1 样品前处理方法

本法基于GB 23200.115—2018，对样品前处理方法进行了改进。准确称取2 g鸡蛋样品(精确至0.01 g)置于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋混匀1 min，振荡提取5 min，加入1 g氯化钠和3 g无水硫酸钠，涡旋1 min，于5 000r·min-1离心5 min。准确吸取1 mL上清液，转移至含50 mg PSA粉末、50 mg C18粉末和150 mg无水硫酸镁的2 mL离心管中，涡旋混匀30 s，于5 000 r·min-1离心5 min，上清液过0.22 μm滤膜，超高效液相色谱-串联质谱测定。

1.4.2 方法评价

从方法的线性范围、检出限、定量限、回收率、精密度以及基质效应等方面，对建立的超高效液相色谱-质谱联用测定鲜鸡蛋中氟虫腈及其代谢物的方法进行评价。

1.5 数据分析

用EXCEL 2010对试验数据进行分析，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 线性

配置浓度为1、5、10、50、100 μg·L-1氟虫腈及其3种代谢物(氟虫腈砜、氟虫腈硫醚、氟甲腈)的系列溶剂标准溶液及基质标准溶液，在设定的色谱和质谱条件下进行测定，标准溶液色谱图如图1所示。依据保留时间对应的峰面积与其浓度进行线性回归分析，氟虫腈及其3种代谢物在1.0～100 μg·L-1范围内线性良好，相关系数(R2)均大于0.99 (表2)。

图1 标准溶液氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈硫醚、氟甲腈的UPLC-MS/MS定量离子质谱图(50 μg·kg-1)Fig.1 UPLC-MS/MS chromatograms for fipronil， fipronil sulfone， fipronil sulfide and fipronil desulfinyl in standard solution (50 μg·kg-1)

2.2 基质效应

基质效应是液相色谱-串联质谱法在做定量分析时的重要影响因素之一。因此，建立方法时对基质效应进行有效评价是十分必要的。通过评估了解基质效应的情况，寻找合适的方法削弱甚至消除基质效应的影响将显著提高分析方法的可靠性。常见的评价方法为考察基质校正曲线线性方程斜率与溶剂校正曲线线性方程斜率比，若两者比值小于1，则代表基质效应以抑制为主；若两者比值等于1，则代表基本无基质效应；若比值大于1，代表基质以增强效应为主。当比值在0.8～1.2时，说明基质效应较弱；当比值小于0.5或大于1.5时，说明基质效应强烈[11]。本实验中，取空白鸡蛋样品，按样品前处理方法进行处理，用基质溶液配置浓度为1、5、10、50、100 μg·L-1氟虫腈及其3种代谢物的系列标准溶液，经仪器测定，按各化合物保留时间对应的峰面积(y)与其浓度(x)进行线性拟合。

由表2可知，本法测定鲜鸡蛋中氟虫腈和氟虫腈砜基质效应呈现增强，而测定鸡蛋中氟虫腈硫脒和氟甲腈基质效应呈现抑制。为准确定量目标化合物，减少基质干扰，试验方法中采用基质标准溶液进行外标法定量分析。

表2 氟虫腈及其代谢物溶剂及基质标准溶液线性方程Table 2 Linear equitation of fipronil and its metabolites in standard solution and its matrix matched standard solution

2.3 方法回收率与精密度

氟虫腈及其3种代谢产物按10、20、40 μg·kg-1三个浓度分别添加至空白蛋白和蛋黄样品中，每个浓度做6个平行样，按方法进行样品处理，基质标校准正曲线定量，计算回收率与精密度。同时分别以S/N≥3、S/N≥10为判断依据确定方法的检出限与定量限。通过对实际鲜鸡蛋样品加标回收检测分析，得到加标回收率为85.8%～105.6%，相对标准偏差均小于11.0%(表3)。经测算，本方法氟虫腈及其3种代谢物的检出限均在0.002～0.02 μg·kg-1，定量限为0.007～0.05 μg·kg-1。

表3 鲜鸡蛋中氟虫腈及其代谢物回收率及精密度Table 3 Recovery and precision of fipronil and its metabolites in fresh eggs

2.4 鲜鸡蛋样品中氟虫腈及其代谢物残留污染分析

样品采样区域包括农贸市场、超市、小区门店等，共抽取样品30批次，开展鲜鸡蛋样品中氟虫腈及其3种代谢物筛查分析。分析结果表明，30批次样品中，氟虫腈及其代谢物检出1批次，残留含量为(10.1±0.25)μg·kg-1，检出率为3.3%。

3 讨论

液相色谱质谱联用技术具有快速、高灵敏度、精准定量的优势，尤其对于复杂基质样品中目标化合物的检测，借助液相色谱质谱联用技术能够达到痕量分析，更好地保障食品的安全性。刘善菁等[12]建立一种液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱方法测定鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留，样品经提取和盐析后，PRiME HLB净化柱快速净化，该方法的回收率为75%～115%，方法的定量限为0.1 μg·kg-1。垄震等[13]建立固相萃取-高效液相色谱法测定鸡蛋中氟虫腈及其代谢物氟虫腈砜、氟虫腈亚砜、氟甲腈的分析方法，4种目标化合物的检测限均在0.05～0.10 μg·kg-1， 加标回收率在80.9%～115.8%。QuEChERS技术自发明以来广泛应用于食品中药物残留分析，通常以乙腈作为提取溶剂，前处理时间短且操作过程简单[14]。本研究利用QuEChERs方法进行前处理，建立了UPLC-MS/MS方法测定鲜鸡蛋中氟虫腈及其3种代谢物。该方法操作简单、快速，试验试剂用量少，提取效率高，氟虫腈及其3种代谢物的检出限均在0.002～0.02 μg·kg-1，定量限为0.007～0.05 μg·kg-1，回收率在85.8%～105.6%。该方法适用于大批量鲜鸡样品中氟虫腈及其代谢物残留的快速筛查分析，可为行政机构农产品质量安全监管提供技术支撑。

市场上采集的30批次鲜鸡蛋样品中，只有1批次样品中检出氟虫腈，残留量为10.1 μg·kg-1，未超过我国限量(20 μg·kg-1)要求，但超过欧盟(5 μg·kg-1)的限量规定。蛋鸡养殖过程中，蛋品和饲料均可能直接接触含氟虫腈的消毒剂受到直接污染，如欧洲的“毒鸡蛋”事件。鸡蛋中农药残留污染途径还包括间接污染。农业生产中，随着农药的广泛使用，饲料用作物在种植、贮存过程中的任何一个环节都可能用到杀虫剂，并存在通过食物链转移至蛋鸡体内沉积，在蛋品中导致农药残留的风险，从而对人体健康造成威胁[15]。随着人们对畜禽产品的需求量越来越大，人们的食品安全意识也在不断提高，控制蛋品中农药残留污染风险尤为重要，首先，科研工作者应积极培育和种植抗性作物，减少作物生长过程中对药物的依赖性；其次，蛋鸡养殖企业应加强饲养管理，做好生物防控，尽可能减少药物使用；其三，行政监管部门应加强农药管理和产品监测，健全农药使用标准，保障生产源头质量安全。