人参皂苷Rb1对人乳腺癌MDA－MB－231细胞上皮－间质转化及ROR1表达的影响

王 楠，廖 莎，陈 璐，黄 超，曹森林，范利锋，王 莹

（1.湖北省十堰市太和医院·湖北医药学院附属医院，湖北 十堰442000；2.湖北省十堰市太和医院·湖北医药学院附属医院生命科学研究所，湖北 十堰442000）

乳腺癌是女性肿瘤中最常见的、死亡率最高的恶性肿瘤[1]，临床主要通过外科手术、放射治疗和化学治疗（简称化疗）相结合的综合治疗方式来提高患者的生存率[2]，尤其是转移性肿瘤患者的最佳选择[3]，但化疗存在恶心呕吐、食欲缺乏、毛发脱落等副作用，导致后期生存质量严重下降[4]。体外研究表明，上皮－间质转化（EMT）在乳腺癌转移到其他器官的过程中起到重要作用，其作用机制为上皮细胞获得间质细胞的生物特性[5]。化疗也可能导致肿瘤细胞的转移，促进其发生、发展[6]，故需找到一种温和的治疗方法来提高乳腺癌患者的生存率。人参为五加科植物，具有补气养血、增强免疫力、维持细胞内外环境稳定等作用[7]，人参有30多种人参皂苷单体，其中人参皂苷Rg1，Re，Rb1为主要效应成分[8]。人参皂苷对多种肿瘤都有很好的治疗作用，其中人参皂苷Rb1对白血病、胃癌和卵巢癌都有一定的治疗效果[9]。Ⅰ型受体酪氨酸激酶样孤儿受体（ROR1）是一种Ⅰ型跨膜蛋白，在胚胎发育和肿瘤发生过程中表达[10]。ROR1在正常组织(甲状旁腺、胰岛、食道、胃和十二指肠[11])等有表达，但在白血病中为过表达，在乳腺癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肾细胞癌[12]等实体肿瘤中尤为突出，且具有促进乳腺癌细胞增殖，抗凋亡和EMT[13]的作用，增强了癌细胞的转移。本研究中探讨了人参皂苷Rb1能否通过影响人乳腺癌MDA－MB－231细胞EMT及ROR1的表达来减缓乳腺癌的发生、发展。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试药与仪器

细胞：人乳腺癌MDA－MB－231细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）。

试药：人参皂苷Rb1（批号为100712－201223，中国食品药品检定研究院）；RPMI1640培养基（批号为502315），胎牛血清（批号为403652），胰蛋白酶（批号为202314），均购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑盐（MTT，批号为601452，美国Sun－Shine公司）。

仪器：ClassⅡ型生物安全柜（瑞士Liestal公司）；600型CO2细胞培养箱（美国Labconco公司）；SE115B型电泳仪（美国Thermo公司）；5320R 4℃离心机，TA500型倒置显微镜，均购自德国徕卡公司；LDZX－50K型高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）。

1.2 方法

细胞培养：细胞复苏后，将人乳腺癌MDA－MB－231细胞株置含有10%胎牛血清、青霉素（每1 mL 100 U）和链霉素（100μg／mL）的RPMI1640培养基中，在5%CO2、37℃培养箱中静置培养，每24 h更换1次培养基，在细胞覆盖率达70%时使用胰蛋白酶消化、传代。

MTT法检测细胞存活率：取对数生长期的人乳腺癌MDA－MB－231细胞，胰蛋白酶消化2 min，轻微吹打，制作细胞悬液，2 000 r／min离心10 min，弃上清液，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，轻微吹打，使细胞悬浮，接种至96孔板，每孔100μL，放入培养箱培养24 h，去除培养基，加入培养基稀释的人参皂苷Rb1溶液，使溶液质量浓度分别为500，250，125，62，31，15，7.5，3.75μg／mL，设置为人参皂苷Rb11～8组，另设空白对照组和阳性对照组（顺铂，10μg／mL），各组6个复孔，培养24 h，去除培养基，加入100μL 10%MTT的空白培养基（5 mg／mL MTT）中，培养4 h后，弃去孔内培养基，加入二甲基亚砜100μL，振荡混匀10 min，采用酶标仪分别于470 nm和590 nm波长处检测吸光度值（A），重复3次，按公式计算细胞生长抑制率[IC50为15.42μg／mL]。

细胞抑制率（%）＝给药组吸光度／对照组吸光度×100%

细胞划痕法检测人乳腺癌MDA－MB－231细胞迁移能力：指定时间内，用不同质量浓度的人参皂苷Rb1（3.75～500μg／mL）处理细胞，并确定后续试验的最佳质量浓度。将细胞以高密度接种于培养板，粘附，过夜。分别加入质量浓度为60，120，240μg／mL的人参皂苷Rb1、阳性对照药物阿霉素75 nmol／L和空白对照，24 h后观察细胞迁移。在划痕（0 h）和24 h后使用TA500型倒置显微镜获得刮擦的图像。检查划痕间隙，并将间隙差异标准化为划痕的0 h间隙距离。

人参皂苷Rb1干预后人乳腺癌MDA－MB－231细胞ROR1 mRNA表达水平检测：提取各组人乳腺癌MDA－MB－231细胞总RNA，进行反转录反应，反应体系为总RNA 1μL，10mM dNTP混合物1μL，Oligo（dT）20（50μmol／L）1μL，DEPC水9μL，混匀后65℃加热5 min，迅速置冰上冷却，瞬时离心后加入，第一链合成缓冲液4μL，0.1 mmol／L DDT 2μL，核酸酶抑制剂1μL，充分混匀，37℃孵育2 min，加 入1μL（200 U）M－MLV逆转录酶，混匀，37℃孵育50 min后再70℃加热15 min，终止反应。实时定量PCR试剂盒测定相关mRNA表达水平，PCR引物序列，ROR1正向引物5′－ATAGGCTCTATATATGCGAGTACG－3′，反向引物5′－TACCATCAGCAGAAGCATATTCAC－3′。实时定量反应体系为SYBR Green qPCR SuperMix 16.00μL，上游引物（5μmol／L）3.50μL，下游引物（5μmol／L）3.50μL，模板DNA 3.00μL，DEPC水6.5μL，总共32.5μL。反应条件：95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，20 s；72℃，10 s；共40个循环。每个样品做3个复孔，通过相对基因定量方法（2－ΔΔCT法）计算、分析mRNA表达水平。

人参皂苷Rb1干预后人乳腺癌MDA－MB－231细胞ROR1蛋白表达水平检测：在无菌操作台上去除细胞培养皿，弃去培养基，加入1 mL PBS溶液和100μL蛋白酶K溶液，刮培养皿底部10 min，使细胞悬浮于溶液中，将液体转移至1.5 mL EP管中，用超声细胞破碎仪(3 000 r／min，2 min)使细胞破碎，4℃离心20 min，取上清液，置1支新的1.5 mL EP管中。采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测细胞中的ROR1蛋白水平。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件进行分析。计量资料以X±s表示，通过单因素方差分析并采用LSD－t法进行多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对细胞存活率的影响

随着人参皂苷Rb1质量浓度的增加，人乳腺癌MDA－MB－231细胞存活率逐渐降低。与空白对照组比较，阳性对照组和人参皂苷Rb1组（1～8组）人乳腺癌MDA－MB－231细胞存活率显著降低（P＜0.05），人乳腺癌MDA－MB－231细胞存活率与人参皂苷Rb1的质量浓度呈负相关，人参皂苷Rb11组（500.00μg／mL）与阳性对照组比较，对人乳腺癌MDA－MB－231细胞存活率的影响无明显差异（P＞0.05）。结果见表1。

表1 不同质量浓度人参皂苷Rb1对人乳腺癌MDA－MB－231细胞生长的影响（n＝3）

2.2 对细胞迁移能力的影响

与空白对照组比较，给予人参皂苷Rb1和阿霉素处理后，人乳腺癌MDA－MB－231细胞的迁移能力降低，随着人参皂苷Rb1质量浓度的增加，人乳腺癌MDA－MB－231细胞的迁移能力逐渐降低（P＜0.05），且呈明显的量－效关系。人参皂苷Rb1高剂量组和阳性对照组对人乳腺癌MDA－MB－231细胞迁移能力的影响效果无显著差异（P＞0.05）。详见表2和图1。

图1 人参皂苷Rb1对人乳腺癌MDA－MB－231细胞迁移能力的影响

表2 不同质量浓度人参皂苷Rb1对人乳腺癌MDA－MB－231细胞迁移能力、ROR1 mRNA表达和ROR1蛋白表达的影响（n＝3）

2.3 干预后细胞ROR1 mRNA表达水平检测结果

与空白对照组比较，人参皂苷Rb1各剂量组和阳性对照组，人乳腺癌MDA－MB－231细胞ROR1 mRNA表达水平降低，随着人参皂苷Rb1质量浓度的增加，人乳腺癌MDA－MB－231细胞ROR1 mRNA表达水平逐渐降低（P＜0.05），且呈明显的量－效关系。人参皂苷Rb1高剂量组和阳性对照组对人乳腺癌MDA－MB－231细胞ROR1 mRNA表达水平的影响无显著差异。结果见表2。

2.4 干预后细胞ROR1蛋白表达水平检测结果

与空白对照组比较，人参皂苷Rb1各剂量组和阳性对照组，人乳腺癌MDA－MB－231细胞ROR1蛋白表达水平降低，随着人参皂苷Rb1质量浓度的增加，人乳腺癌MDA－MB－231细胞ROR1蛋白表达水平逐渐降低，差异有统计学意义（P＜0.05），且呈明显的量－效关系。人参皂苷Rb1高剂量组和阳性对照组对人乳腺癌MDA－MB－231细胞ROR1蛋白表达水平的影响无显著差异。结果见表2。

3 讨论

乳腺癌的分子异质性导致亚命名，而这些亚命名对预后、治疗反应和／或疾病进程具有信息意义[14]。乳腺癌可通过多种转移侵入机制进入其他组织器官，加重病情，但多数研究结果表明，EMT在乳腺癌的侵袭转移过程中起到了重要作用[15]。发生EMT时，肿瘤细胞形态发生改变，由上皮细胞形态转变为梭形间充质细胞形态，导致细胞间的黏附力和极性丧失，且伴有神经型钙黏蛋白和波形蛋白的表达水平增加，上皮型钙黏蛋白表达水平降低，导致细胞迁移能力和侵袭能力增加，促进原发肿瘤的传播[16]。

ROR1在胚胎发育中表达，在许多上皮性肿瘤和某些B细胞恶性肿瘤中表现出高水平和均匀的细胞表面表达。许多肿瘤中ROR1的表达与预后不良密切相关[17]，其在肿瘤中的重要作用促使早期的治疗研究，包括抗ROR1抗体、抗体药物结合物（抗体与细菌毒素融合）的开发、嵌合抗原受体T细胞治疗及小分子抑制剂等[14]。给予iRNA干扰具有转移倾向的乳腺癌细胞系中ROR1 mRNA的表达，或干扰ROR1蛋白的合成后，能抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，同时减少EMT相关基因的表达水平，表明ROR1可能是乳腺癌的治疗潜在靶点。

人参中的人参皂苷种类有30多种，其中人参皂苷Rb1为其重要组成成分，可抑制体外细胞的迁移能力，降低EMT标志物的表达，防止乳腺癌细胞的转移。研究发现，人参皂苷Rg1可激活雌激素反应细胞中相关通路蛋白的表达，降低乳腺癌细胞活性，促进其凋亡，同时可抑制乳腺癌患者体内相关促癌因子的表达，降低乳腺癌术后的复发率[18]。

本研究结果显示，人参皂苷Rb1可抑制人乳腺癌MDA－MB－231细胞的生长，在给予人参皂苷Rb1干预后，人乳腺癌MDA－MB－231细胞的生长受到抑制，且随着人参皂苷Rb1干预剂量的增加，对人乳腺癌MDA－MB－231细胞的抑制率逐渐升高。通过细胞迁移结果显示，随着人参皂苷Rb1剂量的增加，细胞迁移距离逐渐降低，表明人参皂苷Rb1可能通过抑制人乳腺癌MDA－MB－231细胞EMT转化来抑制细胞的转移，达到防止乳腺癌细胞进一步扩散的目的。ROR1可促进人乳腺癌MDA－MB－231细胞的繁殖及迁移能力，干预后，ROR1 mRNA和蛋白表达均受到抑制，表明ROR1可能是人参皂苷Rb1的一个作用靶点，通过作用ROR1基因的表达来抑制人乳腺癌MDA－MB－231细胞的繁殖，达到防止乳腺癌的发生、发展，为乳腺癌的治疗提供了新思路，与细胞迁移力和MTT实验的结果相一致。因此，人参皂苷Rb1可能是通过抑制人乳腺癌MDA－MB－231细胞迁移和ROR1的表达来抑制乳腺癌的发生。

综上所述，人参皂苷Rb1可能通过抑制人乳腺癌MDA－MB－231细胞EMT和ROR1表达来减缓乳腺癌的发生、发展，为乳腺癌的治疗提供了新的研究方向。