真菌筛选及降解光- 氧氧化褐煤工艺条件优化研究

李建涛，刘向荣，杨杰，王之宇

（1. 商洛学院 化学工程与现代材料学院，陕西 商洛 726000；2. 西安科技大学 化学与化工学院，陕西 西安 710054；3. 陕西省尾矿综合利用重点实验室， 陕西 商洛 726000）

我国是煤炭生产和消费大国，随着社会的发展和进步，环境问题越来越受到人们的广泛关注。因此，对于煤，特别是褐煤的高效清洁利用也成为当前科学研究的热点之一[1-3]。煤的微生物降解是褐煤清洁高效利用的前沿技术，因其设备要求简单，转化条件温和，能耗低等优点，极具发展前景[4-6]。该技术发展至今，还未实现工业化的最根本的问题是微生物对煤的降解率低，高效降解菌缺乏。降解率低，使得降解产物的量不够丰富，导致研究对象的匮乏及进一步应用受限，从而极大的阻碍了煤微生物降解技术的发展。有研究[7]发现，自然界褐煤在风化降解过程中，不同时期微生物类群存在明显的演替现象，即放线菌为褐煤风化初期的主要作用菌，随之是细菌，真菌则在褐煤风化的后期起主要作用。可见，煤的微生物降解是分步进行的，多种菌在不同阶段，起不同作用的协同过程。这一研究结果表明，要提高煤的微生物降解率，单个菌株的作用往往有限，只有通过多种菌株的协同配合才能实现高降解率这一目的。由此，我们设想建立煤的微生物分级降解的方法，以实现微生物对煤的协同作用和高效降解。本研究首先筛选出能够降解褐煤的真菌菌株，并利用单因素方法研究降解的工艺条件，为低阶煤的分级降解方法的建立提供支撑。

1 试验部分

1.1 煤样及预处理

试验用煤样为内蒙古胜利褐煤（SLH）、云南昭通褐煤（ZTH）、山西浑源褐煤（HYH）和内蒙古元宝山褐煤（YBH）。各煤样在60℃条件下，烘干3 h，经破碎、粉磨和筛分得到粒度范围均为-0.15+0.075 mm 的煤样。利用自行设计加工的旋转床光化学反应器[8]分别对各煤样进行光- 氧氧化预处理，预处理条件为：加煤量20 g，煤样粒度-0.15+0.075 mm，紫外光强度150 W，马达转速120 r/min，氧化时间42 h，通氧时间40 min。得到光-氧氧化内蒙古胜利褐煤（GSLH）、光- 氧氧化云南昭通褐煤（GZTH）、光- 氧氧化山西浑源褐煤（GHYH）和光-氧氧化内蒙古元宝山褐煤（GYBH）。光- 氧氧化褐煤的工业分析和元素分析结果见表1。

>表1 煤样的工业分析和元素分析/%Table 1 Proximate and ultimate analysis of lignite samples

1.2 菌株及复壮

（1）菌株及培养基

试验选用绿色木霉(Trichoderma viride)、黑 曲 霉(Aspergillus niger)、 裂 褶(Schizophyllum commune)、 黄 孢 原 毛 平 革 菌(Phanerochaete chrysosporium) 和 云 芝(Coriolus versicolor) 5 株 真菌菌种，前两株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），后三株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。所用培养基为改良马丁培养基：蛋白胨5 g，酵母粉2 g，葡萄糖20 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.5 g，（固体培养基加琼脂15 g），蒸馏水1000 mL，pH 值=6.2 ～ 6.6。

（2）菌株的活化及复壮

将斜面保藏的5 株真菌：绿色木霉（TV）、黑曲霉（AN）、裂褶（SC）、黄孢原毛平革菌（PC）和云芝（CV），分别用接种针挑取少许接种至装有10 mL 改良马丁培养基的试管中，然后将试管放入恒温振荡培养箱中，在30℃、振荡频率160 r/min 条件下，培养2 d。分别在倒好的改良马丁培养基平板上划线，置于人工气候培养箱中，在温度30℃，相对湿度80% 条件下，培养2 d，观察无杂菌后，用接种针挑少量菌体放入50 mL 无菌水和玻璃珠的锥形瓶中充分振荡，用接种环蘸取一孔接种于装有10 mL 培养基的试管中，将试管放入恒温振荡培养箱，在30℃、振荡频率160 r/min条件下，培养2 d，用接种环蘸取一孔接种至装有100 mL 改良马丁液体培养基的250 mL 锥形瓶中，置于恒温振荡培养箱，相同条件培养2 d，所得5种菌液作为筛选试验母菌液。

1.3 菌- 煤匹配筛选试验

GSLH、GZTH、GHYH 和GYBH 四种煤样，取试管若干，每个试管装改良马丁液体培养基20 mL，分别做无菌的空白对照试验和5 种真菌对4 种光- 氧氧化褐煤的降解试验。除空白以外的试管，用接种环分别蘸取复壮好的5 种真菌菌液各一孔接种，放入恒温振荡培养箱中，在30℃，振荡频率160 r/min 条件下，培养2 d，接种的培养基变浑浊，所有试管分别加粒度为-0.15+0.075 mm 的煤样0.2±0.0002 g， 放入恒温培养箱中， 继续振荡培养25 d，对每个试验设置三组平行试验。试验结束后，三组平行试验的降解液分别离心（10000 r/min，10 min）， 上 清 液 经0.22 μm 微孔滤膜过滤，以去离子水为参比，检测滤液在450 nm 处的吸光度，求得三组平行试验的A450 平均值作为指标[9-10]。分别比较5 种真菌对4 种光-氧氧化褐煤降解液吸光度的大小，A450 最大者为优势菌株，用于后续试验。

1.4 单因素试验设计

本试验煤种为内蒙古胜利褐煤，煤样预处理方式为光- 氧氧化预处理，菌种为1.3 筛选的优势真菌菌株，培养基为改良马丁培养基，培养温度30℃。除此之外，对加煤量、接种量、培养时间和振荡转速4 个条件进行探讨，确定较佳值。

各工艺条件的单因素试验设计具体如下：分别称取一定量（0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 g）GSLH 煤样，粒度为-0.15+0.075 mm，液体培养基20 mL。接种一定量的黄孢原毛平革菌（PC）母菌液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0）mL，培养箱温度为30℃，一定振荡频率下（60、110、160、210、260）r/min，培养一定时间（6、8、10、12、14、16、18、20）d。培养结束后，三组平行试验的产物分别离心（10000 r/min，15 min），上清液经0.22 μm 微孔滤膜过滤，以去离子水为参比，检测滤液在450 nm 处的吸光度，求得三组平行试验的A450 平均值作为指标，A450值最大者为对应变量的较佳值。

1.5 三种褐煤的降解试验

利用菌株筛选试验确定的降解菌，根据单因素确定的菌株降解GSLH 的较佳工艺条件对GZTH、GHYH 和GYBH 进行降解试验，每个试验设置三组平行试验。培养结束后，三组平行试验分别离心（10000 r/min，15 min），上清液经0.222 μm 微孔滤膜过滤，以去离子水为参比，检测降解液在450 nm 处的吸光度，求得三组平行试验的A450 平均值作为指标，评价降解效果。

2 结果及讨论

2.1 菌株筛选结果

图1 是菌- 煤匹配试验结果柱状图，其中C 表示培养基对光- 氧氧化褐煤的溶煤效果，TV、AN、SC、PC 和CV 表示5 种真菌GSLH、GZTH、GHYH 和GYBH 的降解液吸光度A450 值。

图1 五种真菌降解四种光- 氧氧化褐煤结果Fig. 1 Results of five fungi degrading on four lignites

由图1 可见，培养基C 对光- 氧氧化褐煤的溶解均较低，5 株真菌对4 种光- 氧氧化褐煤均有不同程度的降解。其对光- 氧氧化内蒙古胜利褐煤的降解能力强弱顺序为PC ＞ TV ＞ SC ＞ AN ＞ CV，对光- 氧氧化云南昭通褐煤的降解能力强弱顺序为PC ＞ TV ＞ AN ＞ SC ＞ CV，对光- 氧氧化山西浑源褐煤的降解能力强弱顺序为PC ＞ SC ＞ AN ＞ CV ＞ TV，对光- 氧氧化内蒙元宝山褐煤的降解能力强弱顺序为PC ＞ TV ＞ SC ＞ CV ＞ AN。由此可知，虽然5 种真菌降解光- 氧氧化褐煤能力的顺序有差别，但5 种真菌对4 种光- 氧氧化褐煤的降解能力最强者均为黄孢原毛平革菌（PC）。因此，将黄孢原毛平革菌（PC）确定为降解光- 氧氧化褐煤的优势真菌菌株，用于后续试验。

2.2 单因素试验结果

（1）加煤量

图2 是加煤量对黄孢原毛平革菌降解光- 氧氧化内蒙胜利褐煤降解效果的影响。

图2 加煤量对降解液吸光度的影响 Fig. 2 Effect of coal amount on A450 of degradation liquid

由图2 可见，随着加煤量的增加，指标A450值先增大后减小，当每20 mL 培养基的加煤量为0.3 g 时，A450 达到最大值5.107，加煤量大于0.3 g 后，A450 值急剧下降。原因可能是加煤量较少时，菌株分泌的降解煤活性物质与煤中的活性点充分作用后还有过剩，虽然降解率达到极大值，然而降解产物的浓度相对较低；当加煤量为0.3 g 时，菌株生长过程中分泌的降解煤活性物质与煤中的活性点相互作用程度比较充分，降解率虽然可能未达到加煤量为0.1 g 时的降解率，但由于二者相互作用充分，致使相同体积（这里是20 mL）情况下的降解产物浓度较大，故而A450 值较大；再增大加煤量，由于煤浆浓度过大会抑制菌株的生长，导致菌株生长不旺盛，分泌降解煤活性物质减少，引起A450 值减小。因此，加煤量为0.3 g/20 mL 为较佳加煤量。

（2）接种量

图3 是接种量对黄孢原毛平革菌降解光- 氧氧化内蒙古胜利褐煤的影响。

图 3 接种量对降解液吸光度的影响Fig .3 Effect of inoculation size on A450 of degradation liquid

由图3 可以看出，随着接种量的增大，降解液的吸光度A450 迅速增大，当接种量达到1.5 mL/20 mL 时，降解液的A450 值达到5.092，再增大接种量，A450 值变化较小，故而将1.5 mL/20 mL 确定为较佳接种量。

（3）培养时间

图4 是培养时间对黄孢原毛平革菌降解光-氧氧化内蒙古胜利褐煤的影响。

图4 培养时间对降解液吸光度的影响Fig .4 Effect of incubation time on A450 of degradation liquid

由图4 可见，随着培养时间的延长，降解液的吸光度A450 值逐渐增大，当培养时间达到16 d时，降解液的A450 值达到5.093，再延长培养时间对降解效果的影响不大，基于降解效率的考虑，培养时间确定为16 d。

图5 是培养箱振荡频率对黄孢原毛平革菌降解光- 氧氧化内蒙古胜利褐煤的影响。

图5 振荡频率对降解液吸光度的影响Fig .5 Effect of oscillation frequency on A450 of degradation liquid

由图5 可见，随着振荡频率的增大，降解液的吸光度A450 值先增大后减小，最大值出现在210 r/min 频率处，降解液吸光度在此振荡频率下达到5.270。原因可能是随着振荡频率的增大，培养基的气液界面交替越频繁，使得培养基中的氧含量相对充分，有利于黄孢菌的生长繁衍，菌能够分泌出较多的降解煤活性物质，有利于煤的降解；其次振荡频率越大，降解煤活性物质与煤中的作用点接触更充分，同样有利于煤的降解。当振荡频率过大时，虽有利于氧气的溶解及降解煤活性物质与煤中活性作用点的充分接触，但剧烈的振荡可能导致黄孢菌生长的不适应，后者可能是主要影响因素，从而使得黄孢菌产生降解煤活性物的能力降低，故振荡频率不宜过高，振荡频率210 r/min 为宜。

2.3 优势菌降解三种褐煤效果

图6 是按照单因素确定的较佳工艺条件，利用黄孢原毛平革菌对GZTH、GHYH 和GYBH 进行降解试验，所得降解液在450 nm 处的吸光度值。

图 6 三种光- 氧氧化褐煤的降解液450 nm 吸光度值Fig .6 Absorbance at 450 nm of degradation liquid of three photooxidized lignites

由图6 可见黄孢原毛平革菌在单因素确定的较佳工艺条件下，对三种光- 氧氧化褐煤的降解液吸光度分别为：6.308、4.652 和2.987，这比菌煤匹配试验中，黄孢原毛平革菌对三种光- 氧氧化褐煤的降解液吸光度均有一定程度的提高（分别为：5.192、3.407 和2.987）。可见，以光- 氧氧化内蒙古胜利褐煤（GSLH）为样本，经过单因素试验确定的黄孢原毛平革菌降解GSLH 的较佳条件是黄孢原毛平革菌降解GZTH、GHYH 和 GHYH 的较优工艺条件，具有一定程度的普适性。

3 结 论

（1）菌- 煤匹配试验筛选出的降解光- 氧氧化褐煤的优势真菌菌株为黄孢原毛平革菌。

（2）经单因素试验确定的黄孢原毛平革菌降解光- 氧氧化内蒙胜利褐煤的较佳工艺条件为：加煤量为0.3 g/20 mL，接种量为1.5 mL/20 mL，降解时间为16 d，培养箱振荡频率为210 r/min，煤样粒度为-0.15+0.075 mm，降解温度为30℃。

（3）按照单因素确定的较佳工艺条件，利用黄孢原毛平革菌对光- 氧氧化云南昭通褐煤、光-氧氧化山西浑源褐煤和光- 氧氧化内蒙古元宝山褐煤进行了降解试验，结果表明，降解效果均有一定程度的提升，可见该条件是这三种光- 氧氧化褐煤的较优降解条件。