冷冻电镜的“跨界大咖秀”

李明丽

2020年年初肆虐的“新冠肺炎”疫情对人民健康水平和经济发展，都带来极大影响。疫情发生后，解析病毒结构、研发疫苗进展，这些原本“学术味”十足的关键词，也成了普通老百姓十分关心的话题。

2020年6月份，Science杂志发表西湖大学周强团队最新研究成果：他们利用冷冻电镜技术，解析了新冠病毒S蛋白與中和抗体4A8复合物的结构，为靶向S蛋白N端结构域的药物设计和治疗策略提供了基础。该抗体是由陈薇院士团队从新冠肺炎康复病人的免疫细胞中筛选和鉴定的，具有强病毒中和能力。这一结果早在5月份第一时间向全社会公开。此前，周强团队已分别解析了新冠病毒受体ACE2全长蛋白、S蛋白受体结合结构域与ACE2全长蛋白复合物的近原子分辨率三维结构，并第一时间向全社会公开，随后在3月份被Science杂志刊登封面文章报道。值得注意的是，这些结构解析所依托的冷冻电镜数据，全部通过一套自动化系统所采集。

看清病毒结构，为药物设计提供有力帮助，而解密这些结构，则离不开冷冻电镜平台。这项对生命科学、医学、药学乃至物理化学的研究都有重大意义的平台技术，目前在全世界范围内快速增长。带着诸多疑问，记者走访了清华大学生命科学学院研究员、国家蛋白质科学研究（北京）设施清华大学冷冻电镜平台总管、中国冷冻电镜杰出贡献奖获得者，也是上述自动化系统的开发者——雷建林，听他介绍冷冻电镜的“跨界大咖秀”。

冷冻电镜是怎样为生物学研究推波助澜的？

“冷冻电镜技术，顾名思义，就是应用冷冻固定术在低温下使用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM）观察样品的显微技术，是一种结构生物学技术。为什么要在冷冻条件下观察呢？这是因为生物样品中的生物大分子不耐辐照且含水，如果直接将溶液上的蛋白放在电镜上观察，会破坏其精细结构。这个时候，可以将生物大分子溶液置于电镜载网上形成非常薄的水膜，吸掉多余溶液后快速冷冻形成一层玻璃态的冰，再放到冷冻电镜上观察。这样做，一方面不会破坏电镜的高真空，另一方面更接近生物大分子的生理状态。”雷建林开门见山地介绍。

回溯历史，冷冻电镜样品制备技术的尝试始于20世纪70年代，至1982年开发出真正成熟可用的快速冷冻制样技术。伴随着的是冷冻电镜各种结构解析技术的日渐成熟，包括电子晶体学、单颗粒分析、电子断层术以及近年发展起来的微晶衍射技术。一直以来，在X射线晶体学、核磁共振和冷冻电镜三大结构生物学手段中，冷冻电镜是最弱的一项，但是已到了万事俱备只欠东风的阶段。具有标志性意义的事件是直接电子探测器成功开发并应用于冷冻电镜。2013年年底，加州大学旧金山分校程亦凡研究组和David Julius研究组合作首次利用直接电子探测器K2相机和冷冻电镜单颗粒技术解析了TRPV1膜蛋白3.4埃近原子分辨率结构。冷冻电镜硬件的突破掀起了结构生物学领域的一场风暴，以往依托传统X射线晶体学长期无法解决的许多重要大分子复合体及膜蛋白的近原子分辨率结构，被各个击破。

2020年5月下旬，冷冻电镜单颗粒技术再次打破分辨率纪录。有两个课题组分别利用冷冻电镜新硬件，如冷场电子枪+能量过滤+新型相机、单色器+新型球差校正装置，将去铁蛋白的结构解析分辨率分别推进到1.2埃和1.25埃，达到真正的单个原子水平。“这无疑会继续将这一风暴延续下去。”雷建林介绍。

雷建林表示，依托冷冻电镜技术的发展，人类对细胞内的生命活动有了更多的了解；而随着冷冻电镜技术的不断发展，假以时日，科学家亦将实现对复杂生命体的更多解读。

冷门学科是怎样实现“从0到1”突破的？

对于雷建林来说，是勤奋和机缘让他一次又一次地把握住了机会，并一以贯之地在材料电镜和冷冻电镜方面不断钻研。而他的学习、工作经历，则是冷冻电镜技术人才培养和平台从“从0到1”筹建历程的典型。

从1989年本科进入武汉大学物理系，到1998年获得武汉大学博士学位，并进入中国科学院物理研究所从事博士后工作，十年寒窗为雷建林打下了坚实的科研基础。

自20世纪90年代中期开始，雷建林就以材料电镜为主要手段开展工作，先后师从王仁卉先生和郭可信先生，开始从事准晶热漫散射的定量电子显微学研究。“王先生渊博的学识和严谨的治学态度，让我受益至今；而转向冷冻电镜领域的研究，则受郭先生影响颇深。”雷建林介绍。

1999年11月到2000年1月，在德国慕尼黑大学3个月短期访问学者的经历，更是让雷建林拓展了视野，拓宽了科研思路，也为他后来的冷冻电镜研究打通了“任督二脉”。

2000年起，雷建林的科研工作转向冷冻电镜领域。当时，这个研究方向尚属冷门，他先后在美国纽约州卫生部沃兹沃斯中心及美国哥伦比亚大学跟随冷冻电镜的先驱及单颗粒算法的首创和实现者、2017年诺贝尔化学奖得主Joachim Frank教授进行冷冻电镜的技术研发工作。

2008年年中，清华大学决定建设新的结构生物学实验平台。于是，在雷建林等人的协助下，清华大学购置了亚洲第一台Titan Krios冷冻电镜。同年11月，雷建林回国到正在筹建的清华大学冷冻电镜平台上任主管。

而这台于2009年3月9日到货服役的设备，也为平台的建设和依托平台的科研工作做出了重大贡献。“它在开展单颗粒分析、电子断层成像等三维结构的研究方面有着突出的优势，能够解析蛋白复合物的近原子分辨率结构以及亚细胞器甚至整个细胞的三维结构。”雷建林介绍。

作为全面负责平台管理与运行的总管，雷建林也和这台设备一起，经历了清华大学冷冻电镜平台逐步壮大的全过程。硬件过硬，效率够高，短短数年，平台已发展成全世界最顶尖的冷冻电镜平台之一。如今，平台已有10台冷冻透射电镜包括4台最高端的Titan Krios电镜，还有2台双束显微镜、关联显微镜及和全套相关的辅助设备等。

可以说，平台的飞速发展，与清华大学“既支持又不干涉”的方式分不开；而不断提高的效率，则与平台团队的精细管理息息相关。作为科研工作的重要设施，申请使用的课题项目很多，仅校内需求便已呈供不应求之势。为此，清华大学成立了专门的委员会以评审申请课题，经过审议决定后，再为课题组分配电镜的使用时间。“我们有一套日常的规章制度，每一台设备都有非常严格的使用须知，这样就保证了设备尽可能在一个比较好的状态下运行。同时，因为我们的设备是7×24小时对外服务的，全年无休，针对此，还有一套激励机制，鼓励平台人员及时为用户解决问题，多做研究，多出成果。”

近年来，雷建林还全面负责西湖大学冷冻电镜平台的建设，并为国内众多冷冻电镜平台的建设提供了帮助和建议，助推了我国冷冻电镜的推广和发展。

2014年之前，国内最高端的冷冻电镜还只有3台。从2014年开始，国内外均涌起冷冻电镜的购买热潮。国内很多单位以清华模式为标准陆续建设自己的冷冻电镜平台。据初步统计，到2020年年底，国内安装好的和已经下订单采购的冷冻电镜平台中，最高端的冷冻电镜预计将达40台。

“这7年时间，伴随着冷冻电镜技术的突飞猛进，冷冻电镜平台的建设也遍地开花，这有其合理性，但也有不少非理性的因素。”雷建林感叹。

“每天节省上万元折旧费”的系统能做什么？

冷冻电镜的目标是将结构的解析提高到原子分辨率水平，通常需要通宵达旦收集数天乃至数十天以获得几千数万乃至数十万张电镜照片，如此大规模的数据靠传统的手动采集非常不现实，一方面耗时费力，另一方面效率低下，这实际上已经成为阻碍当前高分辨率的冷冻电镜结构解析的主要瓶颈之一。生物样品普遍具有一定的结构柔性，只有数据量足够大，才能保证结构的有效性。解决这一问题的有效途径就是开发高通量、全自动化的冷冻电镜数据采集系统。

近年来，雷建林先后作为课题负责人和项目骨干，获得国家重点基础研究发展计划和国家重点研发计划的资助。他开发的自动化电镜数据采集技术和各种电镜优化技术广泛应用于冷冻电镜平台，极大地提高了设备的使用效率。

雷建林独立发展的高通量自动化冷冻电镜单颗粒数据收集系统AutoEMation最初只适用于Tecnai系列电镜，随着清华大学引进Titan Krios，2010年扩展至Titan系列电镜。随着直接电子探测器的引入，2016年扩展至直接电子探测器。系统还可根据用户的特殊需要提供深度定制开发，获得了大量的使用。“早在10多年前还在CCD相机时代，我们用移动电子束的方法取代移动样品台的方法，实现了在同一个孔内拍多张照片，从而极大地提高了数据采集效率。到了直接电子探测器K2时期，由于最大的瓶颈是相机数据的吐出速度，移动电子束的方法对效率的提升不够显著。到了K3时期，随着相机数据吐出速度的加快，移动电子束的方法能大幅提升数据采集速度。”雷建林介绍。

这套系统不仅数据获取效率高，还具有走位准确等技术创新点——既适合于所有类型的电镜载网，也适用于在孔洞中位置非常不确定的样品如病毒、微丝、微管等。

此外，这套系统使用灵活，设置简单。“不光支持全自动采集，也支持半自动收集，后者极大方便了用户快速检查样品；简化并自动精确设置低剂量（low dose）成像条件；可选择用物镜（objective lens）或样品台（stage）设置离焦量（defocus），后者特别适用于球差电镜，同时还巧妙地解决了既要尽量保持样品台Z轴不动以减少Z方向motion，又要利用样品台Z轴来设置defocus范围之间的矛盾；数据采集过程中能自动校正能量过滤系统的零峰。”提起系统功能，雷建林滔滔不绝。

值得关注的是，这套系统支持倾转样品的自动化数据采集。核孔复合物（Nuclear Pore Complex，NPC）被认为是结构生物学的圣杯之一。施一公团队最新用单颗粒技术发表的高分辨率的NPC结构，就是用这套系统的倾转功能采集的数据。此外，它还支持相位板数据的自动化采集。王宏伟团队发表了分子量52千道尔顿的链霉亲和素蛋白的3.2埃分辨率冷凍电镜单颗粒三维重构，创造了利用冷冻电镜单颗粒方法解析至近原子分辨率生物大分子分子量最小的纪录，就是用这套系统的该功能采集的。

在自动化采集技术衔接空白期的那段时间里，只能使用人工采集数据，需要三班倒“蹲守”在操作台边，而且操作繁琐、效率低下，操作人员也异常疲倦。而通过这套系统的应用，不仅大幅提高了电镜的有效机时和单位机时的效率，同时还简化了数据收集门槛，“用户经过相关的培训后，不需要掌握更多的技术也可以自己独立完成相应的应用。用户不再需要三班倒，晚上可以睡觉，白天可以继续做其他的工作”。

单台冷冻电镜设备的价格都是数千万元级别的。如此昂贵的设备，效率的提升等同于发挥了社会和经济效益。雷建林介绍：“如果工作效率提高一倍，等于每台高端电镜每天光折旧费就可节省上万元，这还不包括效率提升在科研方面创造的社会效益。”

“接下来最重要的还是继续完善各种自动化技术。”雷建林对未来有着美好的愿景，他预期随着冷冻电镜技术的再发展和突破，冷冻电镜的发展方向应该是直接做原位研究。虽然实现起来困难重重，但是技术一旦突破，将为科研工作带来更多利好。

高光频现的平台上都诞生了什么？

2017年10月4日，瑞典皇家科学院宣布将2017年诺贝尔化学奖颁给对冷冻电镜技术发展做出原创性贡献的3位学者，其中包括雷建林的合作导师Joachim Frank。此举被业界戏称为“一个发给了物理学家的诺贝尔化学奖，以奖励他们帮助了生物学家”，传为佳话。从这项“跨界”大奖上，亦足见冷冻电镜技术在多学科应用中的重要地位。

其实，在冷冻电镜研究领域，清华大学根基深厚。这与多位院士的推动分不开。在国家蛋白质科学研究基础设施立项过程中，施一公院士联合王志新、隋森芳两位院士在清华大学基地计划的约10个平台中选定已经起步的冷冻电镜平台作为重点建设方向。2011年，王宏伟教授入职清华大学领衔清华大学基地建设。

伴随着冷冻电镜技术的异军突起，清华大学冷冻电镜平台高光频现，连续多年诞生突破性重大科研进展：

在2019年度中国生命科学十大进展中，有两大进展离不开这个平台。

其一是“植物抗病小体的结构与功能研究”，由清华大学柴继杰组、中国科学院遗传与发育生物学研究所周俭民组和清华大学王宏伟组合作完成，解析了抗病蛋白ZAR1多个状态复合物三维结构。

其二是“破解硅藻光合膜蛋白超分子结构和功能之谜”。同时还入选了该年度的中国科学十大进展。中国科学院植物研究所沈建仁、匡廷云组在国际上首次用X射线晶体学解析了硅藻捕光天线膜蛋白（FCP） 1.8埃的高分辨率结构，并进一步与清华大学隋森芳组合作用冷冻电镜解析了硅藻光系统II和FCP超级复合物3.0埃的结构。

此前，施一公组在“揭示RNA剪接的关键分子机制”等方面的工作，入选2016年度中国科学十大进展，他本人获得2017年未来科学大奖生命科学奖，以表彰他在解析真核信使RNA剪接体结构和揭示其机理的重大贡献；颜宁组完成的“肌肉兴奋-收缩偶联的分子机理探索”，入选2016年度中国高等学校十大科技进展；杨茂君组在“线粒体呼吸链超级复合物的结构与功能”的工作，入选2016年度中国生命科学十大进展……

令人惊叹的是，上述这些成果的冷冻电镜结构解析数据全部采集于清华大学冷冻电镜平台，绝大部分由雷建林独立开发的自动化系统收集完成。可以说，清华大学冷冻电镜平台的高光频现，也得益于雷建林的管理和开发的技术。

截至2020年5月，依托清华大学冷冻电镜平台，已有超过50篇以冷冻电镜为主要手段的研究论文发表于Nature、Science、Cell三大国际顶级期刊上。平台成为业内标杆的同时，因其平台建设管理和技术研发的贡献，雷建林个人也荣获了第一届“中国冷冻电镜杰出贡献奖”。

在这片孕育科学奇迹的神奇土壤里，雷建林还在不停播种并守望着更加绚烂的未来。

专家简介

雷建林，清华大学生命科学学院研究员，国家蛋白质科学研究（北京）设施清华大学冷冻电镜平台总管。

从20世纪90年代中期开始以材料电镜为主要手段开展工作，先后师从王仁卉先生和郭可信先生从事准晶热漫散射的定量电子显微学研究。1999年年末和2000年年初在德国慕尼黑大学做短期访问学者。2000年转向冷冻电镜领域，跟随冷冻电镜的先驱、2017年诺贝尔化学奖得主Joachim Frank教授进行冷冻电镜的技术研发工作。2008年11月回国任筹建的清华大学冷冻电镜平台主管，历经了清华大学冷冻电镜平台逐步壮大的全过程。目前平台有10台透射电镜包括4台最高端的Titan Krios电镜，还有2台双束显微镜、关联显微镜及和全套相关的辅助设备等。2017年荣获第一届中国冷冻電镜杰出贡献奖。迄今已有60多篇高质量SCI论文的全部冷冻电镜数据都是由他独立开发的自动化系统收集完成，其中CNS论文超过30篇。

助推清华大学冷冻电镜平台发展成全世界最顶尖的冷冻电镜平台之一。近年还全面负责西湖大学冷冻电镜平台的建设。新冠肺炎疫情发生后，西湖大学解析的新冠病毒结构的冷冻电镜数据全部是用雷建林所开发的自动化系统采集的。