应用iTRAQ技术快速鉴定稻米品质差异蛋白的方法分析

闸雯俊 游艾青

摘要：以鄂中5号和桂朝2号为材料，应用iTRAQ技术快速鉴定稻米品质差异蛋白，从而根据差异蛋白快速和有效地筛选到与水稻（Oryza sativa L.）品质相关联的候选基因。结果表明，鄂中5号、桂朝2号共鉴定出水稻显著差异蛋白61个，其中上调蛋白21个，下调蛋白40个。该技术可广泛应用于水稻品质性状的研究和开发并且结合转基因技术培育高档优质水稻品种。

关键词：水稻（Oryza sativa L.）;iTRAQ技术;差异蛋白;鉴定

中图分类号：S511         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）17-0175-03

Abstract： Using Ezhong No. 5 and Guichao No. 2 as materials， the iTRAQ technology was used to quickly identify rice quality differential proteins， so that candidate genes related to rice quality can be rapidly and effectively screened based on the differential proteins. The results showed that Ezhong No. 5 and Guichao No. 2 identified a total of 61 significantly different proteins in rice， including 21 up-regulated proteins and 40 down-regulated proteins. This technology can be widely used in the research and development of rice quality traits and combined with transgenic technology to cultivate high-quality rice varieties.

Key words： rice（Oryza sativa L.）; iTRAQ; differential protein; identify

水稻（Oryza sativa L.）是世界主要粮食作物之一，全球超过一半人口都以水稻作为主食。估计到2025年，世界水稻产量要比现在增长60%才能够满足需要。中国是水稻生产大国，水稻常年种植面积约       3 000万hm2，占世界水稻种植总面积的1/4。因此，水稻的种植安全与中国经济发展和人民生活密不可分。

目前公认的高档优质稻是指稻米的理化品质优异、米粒细长、外观晶莹透明、适口性好、商品价位高、可与泰国香米相媲美的一类水稻品种。试验表明，优质稻的直链淀粉含量为13%～17%，胶稠度65～85 mm，长宽比3.4以上。高档优质稻的理化指标与国标不完全一致，高档优质稻品种在注重精米理化指标的同时，更注重外观品质和适口性，做到好看更好吃。而湖北省高档优质稻种植面积一直徘徊在6万 hm2 左右，仅占水稻种植面积的3% ，高档优质稻产业化开发明显滞后，与市场需求不相适应[1，2]。

同位素相对和绝对定量标记（Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）是最近发展起来的一种新型定量蛋白质组学技术，但目前尚未发现用于快速鉴定稻米品质差异蛋白质组学研究的报道。利用iTRAQ这一高通量、准确的蛋白质组学研究手段来研究与水稻品质相关的候选基因，可广泛应用于水稻品质性状的研究和开发并且结合转基因技术培育高档优质水稻品种。

1 材料与方法

1.1 材料

水稻品种为鄂中5号和桂朝2号子粒。

1.2 方法

1.2.1 iTRAQ标记 采用丙酮沉淀法提取处理组与对照组水稻子粒蛋白质。对提取后的蛋白质样品进行还原烷基化处理，用考马斯亮兰法测定蛋白质浓度，经SDS-PAGE检测后取等量蛋白质样品Trypsin酶解，用iTRAQ 117、iTRAQ 115 标记鄂中5号蛋白质，iTRAQ 113、iTRAQ 119标记桂朝2号蛋白质，最后将标记好的4组样品等量混合，应用强阳离子交换色谱法对混合后的肽段進行预分离，随后再进行液相分离和质谱分析。

1.2.2 差异蛋白的选择 如果某个蛋白的差异倍数（Fold change）>1.20或<0.83，同时经过统计检验，P<0.05便可认为是差异蛋白[3]。

1.2.3 生物信息学分析 对质谱检测结果进行数据查库、定量分析的过程：用ProteinPilot软件的Paragon算法进行肽段、蛋白鉴定和定量，检索数据库为NCBI水稻种属非冗余数据库。搜索参数设置为胰蛋白酶，全酶切方式，最大漏切位点为2，固定修饰为半胱氨酸的甲基甲基硫代甲砜烷基化，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，肽段N端和赖氨酸的iTRAQ修饰;为降低假阳性结果，蛋白鉴定标准设定为ProtScore≥1.3，同时最少使用2条置信度≥ 95%的肽段进行蛋白定量;结果经自动偏离校正以便消除标记样品混合时引入的误差。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测差异蛋白基因 取-80 ℃保存的水稻总RNA，按照反转录试剂盒说明书进行反转录获得cDNA。在 Roteogene 6000TM 定量PCR仪上进行10 μL体系的 PCR 反应，反应条件如下： 94 ℃ 预变性2 min，以30～40 个循环进行 PCR 扩增（94 ℃变性 20 s，55 ℃ 退火 15 s，72 ℃延伸 20 s），每个样品 3 个重复，取平均值。采用 2-ΔΔCt 方法比较不同样品基因表达水平。

2 结果与分析

2.1 GO功能显著富集结果

所有被鉴定蛋白质编码基因的GO功能显著富集，质谱鉴定蛋白质的GO功能产物属性显著富集（-logP≥1.5）在细胞组分中，包括细胞、细胞部分、细胞器、膜、细胞器部分、膜部分、大分子复合体、细胞外区域、膜封闭腔、细胞外区域部分（图1）;其次，GO功能产物属性显著富集（-logP≥1.5）在分子功能中，包括催化活性、结合活性、分子功能调节子、结构分子活性、营养库活性、分子传感器活性、抗氧化活性、转运活性（图2）;最后，GO功能产物属性显著富集（-logP≥1.5）在生物过程中，包括代谢过程、细胞过程、单组织过程类别、对刺激的反应、细胞成分组织或生物发生、生物调节、定位、生物过程调节、信号、解毒、多细胞组织过程、发育过程、繁殖、多生物过程、生殖过程（图3）。

2.2 蛋白质的鉴定及定量

鉴定出水稻鄂中5号/桂朝2号（E5/G2）的显著差异蛋白61个，其中上调蛋白21个，下调蛋白40个（图4）。

2.3 差异表达蛋白质的功能注释及其分类

所有具有高度同源性的差异表达蛋白被分配到16个COG类别（图5）。其中，仅限一般功能预测类蛋白（7个）代表最大的功能类别，其次有6个蛋白参与碳水化合物转运和代谢、5个蛋白参与能量生产和转化和5个蛋白参与翻译、核糖体结构和生物发生。3个蛋白参与RNA加工和修饰，3个蛋白参与翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣，2个蛋白属于功能未知、2个蛋白参与氨基酸转运和代谢，2个蛋白参与无机离子转运和代谢、2个蛋白参与细胞内转运、分泌和囊泡转运，2个蛋白参与次生代谢产物的生物合成、转运和分解代谢。参与细胞壁/膜/包膜生物发生、防御机制、信号转导机制、核苷酸转运和代谢及脂质转运和代谢的蛋白均只有1个。

3 小结与讨论

本研究共筛选到 61个水稻差异表达蛋白，功能分析表明其主要集中于细胞组分、分子功能、生物过程。在细胞组成方面主要分布于细胞和细胞部分，分子功能主要涉及催化活性和结合活性，生物过程主要涉及细胞过程和代谢过程。采用 iTRAQ 技术的水稻定量蛋白质组学研究方法，有效地筛选到与水稻品质相关联的候选基因;同时可广泛应用于水稻品质性状的研究和开发并且结合转基因技术来培育高档优质水稻品种。

参考文献：

[1] 陈柏槐. 湖北省優质水稻现状与发展思路 [J]. 中国稻米， 2004（5）：12-15.

[2] 李芙蓉，聂练兵，凌 高. 湖北省优质水稻生产现状与发展思路 [J]. 安徽农业科学，2006， 34（19）：5059-5061.

[3] ZHAO Y L， ZHOU Y H， CHEN J Q， et al. Quantitative proteomic analysis of sub-MIC erythromycin inhibiting biofilm formation of   S. suis in vitro[J]. Journal of proteomics， 2015，116： 1-14.