肺炎Ⅰ号颗粒对肺炎模型小鼠Th1/Th2细胞因子表达的影响

刘建璇 李会影 于映霞 赫慧 王增玲

【摘要】 目的：探讨肺炎Ⅰ号颗粒对肺炎模型小鼠Th1/Th2细胞因子表达的影响，为药物治疗提供理论基础。方法：选择60只SPF级BALB/C小鼠，采用随机数字表法，将其分为空白对照组、模型组、肺炎Ⅰ号高剂量组、肺炎Ⅰ号中剂量组、肺炎Ⅰ号低剂量组，每组12只。连续给药7 d后，观察各组小鼠肺组织病理学变化情况，检测BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α的水平。结果：肺炎Ⅰ号高剂量组、中剂量组小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平均明显低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）;肺炎Ⅰ号低剂量组小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平与模型组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：肺炎Ⅰ号颗粒能显著减少肺炎模型小鼠的肺部炎症，改善肺组织病理状态;其作用机制与降低肺炎模型小鼠的Th1/Th2细胞因子IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α的表达有关。

【关键词】 肺炎Ⅰ号颗粒 肺炎模型 Th1/Th2

[Abstract] Objective： To investigate the effect of Pneumonia Ⅰ Granules on the expression of Th1/Th2 cytokines in mice with pneumonia， and to provide theoretical basis for drug therapy. Method： A total of 60 SPF BALB/C mice， using the random number table method， they were divided into blank control group， model group， Pneumonia Ⅰ high-dose group， Pneumonia Ⅰ middle-dose group， Pneumonia Ⅰ low-dose group， 12 cases in each group. After 7 d of continuous administration， the changes of lung histopathology were observed and the levels of IL-1β， IL-12， IFN-γ， TNF-α in BALF were measured. Result： The levels of IL-1β， IL-12， IFN-γ， TNF-α in BALF of Pneumonia Ⅰ high-dose group and middle-dose group were significantly lower than those of model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The levels of IL-1β， IL-12， IFN-γ， TNF-α in BALF of the Pneumonia Ⅰ low-dose group compared with the model group， the differences were not statistically significant （P>0.05）. Conclusion： Pneumonia Ⅰ Granules can significantly reduce pneumonia model mice lung inflammation， improve lung tissue pathology; the mechanism of action is associated with decreased expression of Th1/Th2 cytokines IL-1β， IL-12， IFN-γ， TNF-α in mice with pneumonia model.

[Key words] Pneumonia Ⅰ Granules Pneumonia model Th1/Th2

First-authors address： Jilin Academy of Traditional Chinese Medicine， Changchun 130012， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.26.006

肺炎患儿机体感染后，可刺激机体的淋巴细胞分泌不同的细胞因子，从而引发机体发生一系列的炎症反应，表明细胞因子可能在发病过程中发挥着重要作用，是导致机体产生一系列临床表现及免疫紊乱的重要原因[1]。Th细胞是重要的免疫调节细胞，根据分泌的细胞因子不同，分为Th0、Th1、Th2、Th3四个亚型，对机体的特异性免疫和非特异性免疫均有调节作用。正常情况下，机体的Th1/Th2细胞间处于动态平衡。Th1主要分泌IL-12、IFN-γ、TNF-α等细胞因子，介导细胞免疫;Th2主要分泌IL-1β等细胞因子，介导体液免疫;Th1/Th2的动态平衡一旦被打破，机体便会出现免疫异常的相关疾病，因此，维持此动态平衡及机体自身稳定状态具有非常重要的意义[2]。为此，本项目通过建立小鼠铜绿假单胞菌肺炎模型，探讨肺炎Ⅰ号颗粒对肺炎模型小鼠Th1/Th2细胞因子表达的影响，发掘药物治疗肺炎小鼠可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2019年1-12月选取SPF级BALB/C小鼠60只，雌雄各半，體重20～22 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2015-0001。饲养于吉林省中医药科学院动物室，动物室为清洁级，室温：20～25 ℃，相对湿度：40%～60%。通风换气次数≥14次/h，每周更换一次垫草料，光照良好，采用标准饲料喂养。笼具15 cm×18 cm×30 cm，每笼6只动物（标记组别及每只动物序号）。

1.2 实验用药 肺炎Ⅰ号颗粒，是由麻黄、苦杏仁、甘草、石膏、栝楼、黄芩、清夏、葶苈子等十二味中药组成的复方制剂。实验用肺炎Ⅰ号干膏粉，本品呈棕褐色，味微苦、涩。每克粉相当于5.81 g生药，由吉林省中医药科学院制剂室提供。配制方法：临用时将肺炎Ⅰ号颗粒以蒸馏水配成所需浓度，用时摇匀，4 ℃保存。该药具有清热开闭、涤痰平喘之功效，用于小儿肺炎急性期，处于邪热亢盛、正邪相争阶段的治疗。

1.3 菌株 铜绿假单胞菌标准菌株CMCC（B）10104，由上海鲁微科技有限公司提供。将铜绿假单胞菌菌落混悬于PBS液中，充分震荡，混匀，应用血细胞计数板调节密度至1×107 cfu/mL。

1.4 主要仪器、试剂 戊巴比妥钠（生产厂家：国药集团化学试剂有限公司，规格：25 g/瓶）;低速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司，型号：KDC-2046）;酶标仪（上海科华实验系统有限公司，型号：ST-360）;细胞因子试剂盒（IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α）由美国RD公司提供。

1.5 实验方法

1.5.1 分组及造模 实验前小鼠适应性饲养3 d，正常进食，自由饮水。采用随机数字表法，将60只BALB/C小鼠按体重分为5组，空白对照组、模型组、肺炎Ⅰ号高剂量组、肺炎Ⅰ号中剂量组、肺炎Ⅰ号低剂量组，每组12只。各组小鼠造模前称量体重，对照组小鼠腹腔注射生理盐水，经鼻孔滴入生理盐水;其余各组小鼠均腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，小鼠麻醉后，将小鼠头后仰，经鼻孔滴入铜绿假单胞菌液，使菌液流入呼吸道，滴入的同时注意观察小鼠的呼吸情况和鼻尖及耳廓的颜色，若出现窒息情况立即给予牵拉前肢、挤压心脏处理。模型评价标准：（1）观察小鼠的精神、毛色等一般状态，是否存在呼吸困难、皮肤发绀等状况;（2）计算肺炎模型标本中每克肺组织的含菌量，一般认为一个标本中含菌量>1×103 cfu/g为菌液接种成功;（3）小鼠肺组织病理学观察：肺组织标本中毛细血管和肺泡周围存在大量淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞的浸润;支气管肺泡周围存在水肿、充血;伴有纤维素样渗出;支气管肺泡有萎缩、塌陷、坏死灶等情况的出现[3]。

1.5.2 给药 造模成功后，空白对照组和模型组分别给予生理盐水灌胃，肺炎Ⅰ号高、中、低剂量组分别按剂量给予肺炎Ⅰ号颗粒灌胃，肺炎Ⅰ号颗粒的临床等效剂量为37.92 g生药/kg，本次实验涉及的高、中、低剂量组分别为75.84 g生药/kg，37.92 g生药/kg，18.96 g生药/kg。各组小鼠均连续给药7 d，用药期间每天观察各组小鼠表现，如小鼠存活、进食、饮水、活动度、精神状态差，有无竖毛寒战、咳嗽，口鼻分泌物有无增多。给药结束后，小鼠采用腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，麻醉后固定于解剖板。75%酒精消毒后，剖胸腔，从右心室插至肺动脉，生理盐水快速冲洗干净后，4%的甲醛溶液注入进行内固定，待小鼠全身僵硬固定后取肺上叶，放入4%的甲醛溶液外固定24 h以上，然后采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α等细胞因子的水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比較采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般资料比较 空白对照组，雌6只，雄6只，平均体重（20.7±2.3）g;模型组雌6只，雄6只，平均体重（20.9±2.5）g;肺炎Ⅰ号高剂量组雌6只，雄6只，平均体重（20.6±2.1）g;肺炎Ⅰ号中剂量组雌6只，雄6只，平均体重（21.1±2.4）g;肺炎Ⅰ号低剂量组雌6只，雄6只，平均体重（20.9±2.3）g。各组小鼠一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 各组小鼠一般状况观察 铜绿假单胞菌接种后第1天，小鼠的进食、饮水、活动度正常，精神状态略差。接种第2天开始，小鼠的进食、饮水明显减少，活动度开始下降，精神状态差，竖毛寒战，尤其是口鼻部分泌物明显增多，频繁出现张口呼吸、打喷嚏、咳嗽等症状。空白对照组小鼠的一般状况无异常表现。

2.3 各组小鼠肺组织病理学变化情况 空白对照组正常小鼠肺组织内解剖位置内未见炎细胞浸润，气道通畅，未见炎性渗出，肺泡形态规整，未见肺泡间隔增宽，为正常肺组织，见图1。铜绿假单胞菌肺炎模型组小鼠，肺组织内可见较大肺脓肿，大量中性粒细胞集中分布在肺内主气道附近的肺泡与肺间隔内，局部肺泡结构破坏、崩解、出血;部分肺间隔增宽增厚，其内可见炎细胞聚集性浸润;残存肺泡扩张融合，形成较小的肺气肿，符合典型肺炎急性感染期的形态变化，见图2。肺炎Ⅰ号高剂量组肺炎小鼠肺内炎症浸润程度与累计范围明显减轻，与模型组比较，肺组织病理状态改善明显，见图3。中剂量组肺内气道周围可见轻度炎症反应，肺泡间隔中度增宽，肺泡中度扩张，未加明显肺实变与肺脓肿形成，有效减少愤怒炎症反应，有效保护肺脏对抗细菌攻击，见图4。低剂量组肺内气道旁可见中度炎症反应，肺泡间隔增宽，可见局部肺泡融合，炎细胞浸润程度重于高、中剂量组，与模型组比较，炎症程度与受累范围有减轻，可以在一定程度上，控制炎症的扩散范围，见图5。

2.4 肺炎Ⅰ号颗粒对于肺炎模型小鼠BALF中细胞因子表达的影响 模型组小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平均明显高于空白对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）;肺炎Ⅰ号高剂量组、中剂量组小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平均明显低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）;肺炎Ⅰ号低剂量组小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平与模型组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

3 讨论

小儿肺炎被世界卫生组织列为全球三种重要的儿科疾病之一，我国政府也将其列为儿科重点防治的四种疾病之一[4]。肺炎Ⅰ号颗粒是在祖国传统医学理论指导下，经临床医院长期应用而确定的经验方，该方是基于“开”法治疗痰热闭肺型小儿肺炎的全新研究，治疗时通过向外、向上宣肺、清肺以祛邪，向内、向下肃降痰热水湿，以恢复肺的升降出入功能。本项目通过深入研究中医药治疗小儿肺炎的优势特色，旨在发掘中医药治疗小儿肺炎的创新技术方法，为进一步促进中医药事业发展贡献力量[5-6]。

铜绿假单胞菌是全球公认的医院获得性感染最常见、最重要的致病菌之一，在呼吸内科住院患者肺部感染病原菌中，革兰阳性杆菌感染约为47%，铜绿假单胞菌约占15%。呼吸系统感染疾病在临床上较为常见，但实验动物通常对于致病菌具有较强的耐受性，为了建立稳定可靠的肺炎模型，关键在于选取致病力强而毒性稳定的感染菌株，且造模过程操作熟练，切实保证小鼠肺炎模型的成功率，从而建立与人类肺炎疾病相似的模型[7-12]。

本实验采用铜绿假单胞菌标准菌株CMCC（B）10104建立小鼠肺炎模型，造模成功率高，模型小鼠肺组织内可见较大肺脓肿，局部肺泡结构破坏、崩解、出血;部分肺间隔增宽增厚，其内可见炎细胞聚集性浸润;残存肺泡扩张融合，形成较小的肺气肿，符合典型肺炎急性感染期的形态变化[13-20]。通过采用ELISA法检测BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平发现，模型组小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平均明显高于空白对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）;肺炎Ⅰ号高剂量组、中剂量组小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平均明显低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）;肺炎Ⅰ号低剂量组小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平与模型组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

综上所述，肺炎Ⅰ号颗粒能显著减少肺炎模型小鼠的肺部炎症，改善肺组织病理状态;其作用机制与降低肺炎模型小鼠的Th1/Th2细胞因子IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α的表达有关。

参考文献

[1] Li Z，Clemens D L，Lee B Y，et al.Mesoporous silica nanoparticles with pH-sensitive nanovalves for delivery of moxifloxacin provide improved treatment of lethal pneumonic tularemia[J].ACS Nano，2015，9（11）：10778-10789.

[2]马菲菲，车向前，林育红.铜绿假单胞菌肺部感染小鼠模型中IL-17A的表达研究[J].中国微生态学杂志，2014，26（12）：1396-1397，1404.

[3] Merchabt Z，Buckton G，Taylor K M，et al.A newera of pulmonary delivery of nano-antimicrobial therapeutics to treat chronic pulmonary infections[J].Curr Pharm Design，2016，22（17）：2577-2598.

[4]徐辉，何晓静，李晓冰，等.铜绿假单胞菌慢性肺部感染合并免疫低下大鼠模型的建立[J].中国医院药学杂志，2017，37（24）：2428-2431.

[5] Nicolls M R，Haskins K，Flores S C.Oxidant stress， immune dysregulation， and vascular function in type Ⅰ diabetes[J].Antioxid Redox Signal，2012，9（7）：879-889.

[6]丁凤鸣，陈宇清，廖若敏，等.SOCS3过表达对铜绿假单胞菌慢性肺部感染小鼠Th17免疫反应的影响[J].免疫学杂志，2017，33（5）：389-393，399.

[7] Yoshimura A，Suzuki M，Sakaguchi R，et al.SOCS，inflammation，and autoimmunity[J].Front Immunol，2012，3：20.

[8]杨青梅，张苹，沈策.铜绿假单胞菌慢性肺部感染模型的建立及评价[J].中国呼吸与危重监护杂志，2008，7（1）：40-42，56，80.

[9]李春江，孙蕾，张敬凯，等.铜绿假单胞菌医院感染分布及耐药性分析[J].中国微生态学杂志，2009，21（6）：540-542.

[10] Izzard A S，Rizzoni D，Agabiti-Rosei E，et al.Small artery structure and hypertension： adaptive changes and target organ damage[J].J Hypertens，2011，23（2）：247-250.

[11]宋方，呂欢，何晓静，等.大鼠铜绿假单胞菌慢性肺部感染模型的建立与评价[J].中国医院药学杂志，2015，35（9）：786-789.

[12]董培红，李骥，张慧芳，等.铜绿假单胞菌的临床分布和耐药性变迁[J].中国微生态学杂志，2007，19（5）：452-454.

[13]谭中富，杨明.炎琥宁注射液辅助治疗难治性肺炎支原体肺炎患儿的临床疗效及其对免疫功能、细胞因子的影响研究[J].实用心脑肺血管病杂志，2017，25（7）：48-52.

[14]陈柱荣.儿童支原体肺炎诊断及治疗的研究进展[J].中外医学研究，2014，10（9）：162-164.

[15]杨新利，陈丽萍，李霞，等.痰热清注射液佐治小儿肺炎支原体肺炎对辅助T细胞及其细胞因子的影响[J].儿科药学杂志，2015，21（7）：33-36.

[16]施弦，郁峰，黄秋玲.支原体肺炎患儿的临床特点分析[J].中华医院感染学杂志，2014，13（1）：206-207.

[17]李晓丹，程燕，陈慧.小儿肺炎支原体肺炎的细胞免疫功能研究进展[J].现代中西医结合杂志，2010，19（17）：2202-2203.

[18]陈广道，梁少媛，冯柏潮.儿童支原体肺炎的临床表现和实验室检查及影像学特点分析[J].中国全科医学，2015，8（1）：59-64.

[19]王有鹏，景伟超，谭杰军.儿童支原体肺炎IFN-γ、IL-4水平中西医研究现状[J].中医药学报，2014，16（4）：133-135.

[20]王树坚.血清Th1/Th2细胞因子检测对儿童支原体肺炎的应用分析[J].中国社区医师，2016，32（33）：142-143.

（收稿日期：2020-03-04） （本文编辑：张爽）