低双乙酰酿酒酵母的复合诱变选育研究

李忠英 罗跃中 王潇蕤

摘  要：双乙酰是啤酒发酵时产生的一种非常重要的发酵副产物，也是判断啤酒是否成熟的重要标准。文章主要是对低双乙酰酿酒酵母的复合诱变选育进行探索研究，通过进行诱变选育来选择双乙酰值比较低的啤酒酵母菌株，并用于啤酒的酿造，使双乙酰值能够符合标准。

关键词：低双乙酰;酿酒酵母;诱变选育

中图分类号：Q813.5        文献标志码：A         文章编号：2095-2945（2020）32-0065-02

Abstract： Diacetyl is a very important fermentation by-product produced during beer fermentation， and it is also an important standard to judge whether the beer is mature or not. The main purpose of this paper is to explore the compound mutagenesis breeding of low diacetyl saccharomyces cerevisiae， select the beer yeast strain with relatively low diacetyl value through mutagenesis breeding， and use it in beer brewing， so that the diacetyl value can meet the standard.

Keywords： low diacetyl; saccharomyces cerevisiae; mutagenic breeding

引言

双乙酰是一种独特的风味物质，其特征是带有一股类似于馊饭的味道。在生产啤酒时，啤酒的成熟度以及口感可以通过检测双乙酰的含量来判断，其风味阈值是0.2ppm。其前驱体为a-乙酰乳酸，a-乙酰乳酸是经过啤酒酵母的帮助在乙酰羟酸合成酶的作用下产生的，并且经过非酶氧化的途径在细胞的外部产生双乙酰。对其含量进行合理的控制能够使啤酒的口感得到保证。在啤酒生产中，如何降低双乙酰的含量，从而提高啤酒的质量，是啤酒生产企业面临的直接问题。本文采用用紫外和微波对啤酒酵母进行诱变育种的研究，以此来获得SM抗性突变株。经发酵后，检测其双乙酰的含量，选择双乙酰含量比较低的菌株。

1 啤酒发酵时双乙酰的产生机制以及分解途径

双乙酰是影响啤酒整体风味的重要因素，也是判断啤酒是否成熟的重要标准，它是小麦经过了多种变化后的产物。在啤酒中，双乙酰的风味阈值一般为每升0.15mg，如双乙酰含量超标，就会导致啤酒出现不良口味，让啤酒产生一种馊饭味，使其口感降低。因此，在啤酒的生产过程中，必须降低双乙酰的含量，使其控制在合适的范围内，提高啤酒品质。在进行啤酒的发酵时， 啤酒酵母会产生大量的a-乙酰乳酸，但是由于其合成以及分解的不平衡，容易导致其在啤酒酵母不断的积累，而其中会有一部分分泌到了细胞之外的啤酒发酵液中，经过反应后产生双乙酰。啤酒酵母可以通过反应产生还原酶，将双乙酰通过反应后进行还原，变成乙偶姻，经过降解反应后生成丁二醇，但是丁二醇和乙偶姻对啤酒的口感等因素没有任何的影响。不过啤酒在进行后期发酵时，酵母的含量大大减少，使得双乙酰的还原效率非常低，需要很久的时间才能将啤酒中的双乙酰降到合理的值，从而对啤酒的生产周期产生了很大的影响[1]。

2 啤酒生产中控制双乙酰的途径

控制啤酒中的双乙酰的含量的途径有以下三个途径，第一是控制a-乙酰乳酸的量，在进行啤酒生产时，双乙酰是啤酒酵母合成缬氨酸和亮氨酸过程中产生的，抑制a-乙酰乳酸的产生，从而直接达到控制啤酒中双乙酰的目的。第二是提高a-乙酰乳酸的降解速度，在啤酒发酵时，a-乙酰乳酸需要漫长的非酶促氧反应才能生成双乙酰，但是如果将发酵液中的a-乙酰乳酸直接转化为乙偶姻，跳过产生双乙酰的中间步骤，就可以达到降低双乙酰含量的目的。第三种方式是使双乙酰的转化速度加快，一旦提高双乙酰的转化速度，就可以直接控制啤酒中的双乙酰含量[2]。

2.1 定向的驯化筛选双乙酰降解速度比较快的酵母菌株

通过人为的因素让菌株向着规定的方向进行发展是一种进行微生物选择的一种有效方法。有研究发现，将酵母菌APV涂抹在双乙酰的培养基中，经过了6代的定向驯化，从中筛选出了优质的菌种，发酵实验表明，双乙酰在啤酒发酵液中降低了接近五分之一。

2.2 诱变获得双乙酰低产酵母菌株

通过诱变方式进行低双乙酰酵母菌株進行选育，通过紫外诱变获得的产低双乙酰酵母突变株，其发酵后的双乙酰含量比原始的菌株降低了20%左右，而其他的生物特征却没有发生明显变化。张智维等[4]利用激光诱变的方式获得了一株效果非常好的酵母突变株，其双乙酰含量仅仅为0.26mg/L，只有原值菌株的一半左右。

2.3 高温发酵

酵母内酶的作用与温度密切相关，在保证酶活性的前提下，温度越高，则反应的效果越快，故在一定程度上合理的提高发酵的温度，可以使双乙酰的还原速度加快，使发酵的周期缩短，提高生产效率。在啤酒的生产旺季时，适当的提高发酵的温度可以有效的使生产能力加快。本生产工艺发酵温度为11℃左右，其发酵周期为25天左右，进入后期发酵期时，第十五天其双乙酰的含量为0.11mg/L。因我校有10T的原浆啤酒，所以将其发酵温度提高至14℃时，其发酵周期为18天，在第十五天再次进行双乙酰的测量，其含量仅为0.08mg/L，这充分说明了提高发酵温度可以有效的降低双乙酰的含量，从而使发酵周期大大缩短[5]。

3 低双乙酰诱变育种的研究

3.1 通过紫外进行诱变育种

紫外诱变育种的方法操作简便，使用效率高，操作时安全，所以在诱变育种中受到了比较广泛的使用，其波长在250mm时最适合用来诱变育种。此时的DNA吸收量最大，嘧叮对于紫外线的敏感度比较强，紫外线作用的产物主要是两个嘧啶之间形成二聚体，它会减弱双链之间氢的作用，导致双链结构出现变形，阻碍碱基之间的配对，引发DNA发生突变或者直接死亡。嘧啶二聚体不仅可以通过单链上相邻的嘧啶之间的反应，对于双链相对应的两个嘧啶之间也可以发生反应，从而对DNA的复制和转录进行影响。紫外线还能够引起碱基的突变和缺失等。

3.2 激光诱变育种

激光是一种量子流，可根据其波长的不同划分为紫外激光、N2激光等。激光诱变是属于物理的范畴，其产生反应的来源是其产生的光、电、热以及磁效应所产生的聚合作用。引起生物的分子出現变异，电磁场产生的自由基，导致生物的DNA出现损伤或者突变，而热效应导致酶失去原有的活性，出现生理或者遗传变异。低功率的激光诱变育种能够对生物体产生遗传或者变异的主要因素是激光的光效应或者是电磁场效应。激光诱变技术在生物育种中使用的比较广泛。红外或者紫外的波长，每个阶段都有不同的效果。激光诱变是一种新型的育种技术，相对于紫外诱变或者化学诱变而言，它具有能量高、方向性好等特点，故在生物育种中得到了广泛的使用。有研究通过使用He-Ne激光对酿酒酵母进行了诱变处理，经过后续的研究发现，酿酒酵母的细胞分裂受到了很大程度的影响，对100多株菌类进行了研究，收获了3株出现突变的菌株。乙醇率比没有经过突变的菌株提高了0.08。

3.3 通过微波辐射进行诱变育种

微波辐射用来诱变育种其生物效应的来源也是光、电、热以及磁效应所产生的综合作用。这种诱变育种方式操作简便，效率高。因此生物育种方面值得研究。微波的本质是一种波，其能够使生物产生反应的区间为300MHz左右。将微波投入到生物的研究中，主要表现方式为两点，即热效应和非热效应。热效应的反应过程是生物中的蛋白质分子在受到微波的强烈刺激时，会随着外场的变化而转动，从而使各分子之间会出现剧烈的摩擦，进而产生能量，使温度出现上升，引起生物的生理反应甚至是死亡。而非热效应到目前为止也没有详细的定论，但是有几种解释比较合理：第一种为微波的交变电场对微生物细胞内部的DNA产生了洛伦兹力，使其产生运动，从而导致了DNA的突变。第二种为微波具有穿透性，使细胞内部和外部的水分子产生剧烈的运动，使细胞的代谢速度加快，更加容易分泌。第三为微波可以让水分子在短短的一秒钟内转动24亿多次，其强烈的运动使细胞内的DNA分子的氢链出现了一定程度的损坏，导致DNA的结构出现了不同的变化。早在上世纪70年代，就有研究人员在微波中进行了菌体、病毒孢子等低等真核生物的突变实验。在此之后，微波诱变在沙门氏菌、酵母等诱变育种中效果较好[6]。

3.4 离子注入诱变育种

离子注入的原理是让离子进入到生物体内，导致生物出现变异。离子注入具有突变几率非常高，生物死亡的几率低等特点。在生物的诱变育种领域受到了非常普遍的使用。其具有独特性。第一，离子注入会产生集合能量沉积、动量传递、质量沉积、电荷中和为一体的生物效应。从而导致生物体产生染色体重复，DNA破裂、死亡等多种生物效应。第二，离子注入不同于电荷、能量等组合，可以提供很多诱变所需要的物质基础，从而使其发生多种变化。第三，离子注入拥有多种选择区域，其效果可控，可以多生物进行指定区域的诱变，其注入的参数和种类都处于可控范围内，使其注入的各项参数可以根据需要进行组合，为生物的诱变提供了新的途径[7]。

4 结束语

本文采用紫外诱变育种、激光诱变育种、微波辐射诱变育种以及离子注入诱变育种等方式对低双乙酰酿酒酵母的复合诱变选育进行了研究，并对每个诱变育种都进行了详细的分析，效果明显。在如今激烈的市场竞争中，啤酒的质量是取胜的关键，只有选择双乙酰值比较低的啤酒酵母菌株，对啤酒中双乙酰的指标进行严格的控制，从啤酒质量上取得竞争优势。

参考文献：

[1]陈茉.低双乙酰啤酒酵母的诱变育种研究[D].黑龙江：黑龙江大学，2010.

[2]王芬.优良啤酒酿造酵母菌株选育途径的探讨[D].福建：厦门大学，2007.

[3]屠令臣，刘凤珠，王连合，等.全小麦啤酒酵母菌株“商啤3号”的诱变育种及应用研究[Z].河南府泉酒业有限责任公司，郑州轻工业学院，2008.

[4]张智维，王旭，刘金平.He-Ne激光诱变选育双乙酰生成量低的啤酒酵母[J].激光技术，2005，29（5）：541-542，557.

[5]汪志君，高庆，方维明，等.紫外诱变筛选低高级醇和双乙酰含量的啤酒酵母[J].中国酿造，2005（1）：13-17.

[6]北京燕京啤酒股份有限公司.一种酿酒酵母诱变菌株及其应用：CN201510416932.9[P].2015-11-04.

[7]张智维，张璐，代春吉.低双乙酰啤酒酵母激光诱变条件的研究[J].中国酿造，2005（3）：27-28.