瑶药满山香总黄酮提取工艺的优化

唐春丽　魏江存　陆梅元　谢臻　陈宏夏　赵凤仙

摘要：采用回流提取法提取满山香（Schisandra propinqua）总黄酮，通过单因素试验，考察提取方法、提取溶剂体积分数、提取液体积、提取时间对药材总黄酮含量的影响，采用正交试验，优化提取工艺条件，筛选出满山香总黄酮的最佳提取工艺。结果表明，满山香总黄酮的最佳提取工艺为60%乙醇、料液比1：40（m： V）、回流提取时间1.0 h。该方法能有效测定满山香药材总黄酮的含量，重复性较好、稳定可行。

关键词：满山香（Schisandra propinqua ）;总黄酮;提取工艺

中图分类号：R282 文献标识码：A

文章编号：0439-8114 （2020） 16-0126-04

DOI： 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.028

满山香来源于木兰科植物合蕊五味子[Schisandrapropinqua （WaII.） Baill. var. iutermdida A. C. Smith]的干燥藤茎和根，为广西常用药材，具有舒筋活血、消肿止痛的功能，用于治疗骨折、慢性胃肠炎、风湿性关节炎、痛经、外伤出血等病症[1，2]。以满山香为主要原料的灯银脑通胶囊用于中风中经络、瘀血阻络的治疗。目前，野生满山香植物资源种群稀少，蕴藏量小[3];瑶药满山香含有木脂素类[4-6]、黄酮类[7，8]、挥发性[1]等成分。黄酮类化合物是广谱生物活性物质，普遍存在于植物中，具有抗癌、防癌、抑菌、抗病毒、降低胆固醇等药理作用与生物活性，以及对内分泌系统[9]和免疫系统等有很好的保护作用[10-13]。

本研究以瑶药满山香总黄酮含量为指标，采用单因素试验考察了提取方法、提取溶剂体积分数、提取液体积、提取时间对提取满山香药材总黄酮含量的影响，并采用正交试验进一步优选最佳提取工艺，为进一步研究满山香药材的质量标准提供了一定的参考依据。目前，国内对满山香药材总黄酮含量测定的相关研究鲜见报道，为保证其药材质量及临床疗效，本试验建立满山香总黄酮的含量测定方法，为后期开发、利用其药用资源提供科学依据。

1材料与方法

1.1仪器

UV1780型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）;XS105D型十万分之一天平（梅特勒-托利多称重设备系统有限公司）;KQ5200B超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）;数显电子恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）;优普ULUPURE实验室超纯水仪（上海优普实业有限公司）。

1.2 材料

芦丁，纯度>98%，购于上海融禾医药科技有限公司;甲醇、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等所用试剂均为分析纯。药材采摘于广西贺州市富川瑶族自治县，经广西中医药大学药学院陈勇教授鉴定为木兰科植物合蕊五味子，经52 ℃烘干，备用。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备 精密称取105 ℃干燥到恒重的芦丁对照品适量，加60%乙醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，摇匀，制成浓度为0.4482 mg/mL的对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液制备 精密称取瑶药满山香药材粉末1.0 g，置于100 mL的锥形瓶中，加入25 mL体积分数为60%的乙醇，称定其重量，水浴回流提取1.0 h，再称定重量，使用60%乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液2.0 mL，置于50 mL容量瓶中，依据总黄酮的测定方法测定其吸光度，用线性方程求出样品溶液中总黄酮的含量，计算得到满山香药材总黄酮含量。

1.3.3 检测波长的选择 精密量取上述对照品溶液3 mL于25 mL容量瓶中，再加入1mL的5%亚硝酸钠溶液，轻轻摇匀，靜置6 min后加入1 mL的10%硝酸招溶液，摇匀，静置6 min，再加4%氢氧化钠溶液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置12 min，以相应试剂作空白，采用分光光度法在400～800 nm测定吸收光谱，其最大吸收波长为512 nm。

1.3.4 标准曲线的绘制 分别取“ 1.3.1”的对照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mL 于 25 mL 容量瓶中，加5%亚硝酸納0.4 mL，放置6 min后，加10%硝酸铅0.4 mL，放置6 min，再加4%的氢氧化钠4mL，加水至刻度，摇匀，放置10 min，然后在512 nm测定[18]。

1.3.5 单因素试验

1） 提取方法。取满山香药材粉末1.Og，精密称定，置于锥形瓶中，提取时间1 h、25 mL、60%乙醇为提取条件，分别采用超声提取法、回流提取法和浸渍法对药材进行总黄酮提取，考察不同提取方法对满山香总黄酮提取率的影响。

2） 乙醇溶剂体积分数。取药材粉末1.Og，精密称定，置于锥形瓶中，提取时间1.0 h、25 mL不同体积分数（30%、50%、60%、70%和85%）的乙醇溶剂为提取条件，采用回流提取法，分析乙醇溶剂不同体积分数对药材总黄酮提取率的影响。

3） 提取时间。取药材粉末1.Og，精密称定，置于锥形瓶中，以60%乙醇25 mL为提取条件，采用回流提取法，分析提取时间对药材总黄酮提取率的影响，设提取时间为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h。

4） 提取液体积。取药材粉末1.Og，精密称定，置于锥形瓶中，提取时间1h、60%乙醇为提取条件，采用回流提取法，分析乙醇不同体积对药材总黄酮提取率的影响，设计60%乙醇提取体积分别为20、30、40、50、60、70 mL。

以上单因素试验按“1.3.2”的操作步骤制备供试品，按“1.3.3”的方法显色测定。

1.3.6 正交试验设计 从中药满山香中提取药材总黄酮的方法主要为有机溶剂提取法。根据查阅的相关文献[14-17]，本试验最终采取不同体积分数乙醇为溶剂的提取方法，根据单因素考察结果，设置乙醇体积分数（50%、60%、70%）、料液比（1：30、1：40、1：50，m：V，下同）、提取时间（1.0、1.5、2.0 h）这3个条件。根据正交设计助手软件，使用L9（34）正交试验设计方法，试验因素和水平见表1。

2结果与分析

2.1 线性方程的制定

以吸光度对芦丁溶液浓度绘制标准曲线，线性方程为y=13.042x-0.038 5，R2=0.999 1，在0.008964～?0.071712 mg/mL浓度与吸光度有良好的线性关系。

2.2方法学考察

2.2.1 精密度试验 精密称取满山香药材粉末1.0g，按“1.3.2”的操作步骤制备供试品，按“1.3.3”的方法显色测定。于512 nm波长下连续6次测定其吸光度，结果为1.06%，小于3.00%，表明该方法精密度良好。

2.2.2 稳定性试验 取满山香药材粉末1.0 g，精密称定，按照“1.3.2”的操作步骤制备供试品，按“1.3.3的方法显色测定，测定同一供试液在不同时间下的吸光度，于512 nm波长处分别在0、10、20、30、40、50、60 min测定吸光度，计算药材的RSD值为2.41%，小于3.00%，吸收度在60 min内基本不变，表明样品在60 min内基本稳定。

2.2.3 重复性试验 精密称取瑶药满山香药材粉末样品6份，每份约1.0 g，按“1.3.2”的操作步骤制备供试品，按“1.3.3”的方法显色测定。于512 nm波长处平行测定其吸光度，计算满山香药材总黄酮的平均含量为 22.78 mg/g，RSD 值为 2.79%，小于 3.00%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 加样回收率试验 取同一批次已知总黄酮含量的满山香药材粉末（含量为22.78 mg/g）0.5 g，精密称定，共9份，分成3组，即低、中、高加样组（0.5 g药材总黄酮含量的80%、100%和120%加样，精密加入芦丁对照品，加样量分别为9.20、11.40、13.65mg），按“1.3.2”的操作步骤制备供试品，按“1.3.3”的方法显色测定。于512 nm波长处平行测定其吸光度，计算总黄酮的含量。由试验结果分析可知，满山香药材的低、中、高加样组总黄酮的平均回收率分别为 98.78%、100.56%、99.40%，RSD分别为 2.59%、2.04%、2.93% （n=3），表明该方法准确性良好，结果见表2。

2.3单因素试验结果

由图1可知，不同提取方法对满山香总黄酮提取率的影响中，回流提取法的提取率最高，故而选择回流提取进行后续试验。由图2可知，60%乙醇回流提取满山香叶总黄酮的提取率最高。不同提取时间对满山香总黄酮提取率的影响结果（图3）表明，提取时间为1.5 h时，总黄酮提取率最高。由图4可知，结果显示提取液体积为40 mL时，满山香总黄酮提取率最高。

2.4 正交试验结果与分析

2.4.1 正交试验结果 根据正交设计助手软件、正父试验结果（表3）和方差分析结果（表4）可知，以瑶药满山香总黄酮的含量为试验指标，由于各试验因素对满山香药材总黄酮提取效果的影响程度不同，乙醇体积分数和料液比对满山香总黄酮的提取工艺有显著影响，而提取时间对满山香总黄酮的提取工艺无显著影响，且各影响因素的大小顺序为料液比（5）>乙醇体积分数（4）>提取时间（C），考虑试验的效率、时间以及成本，故而选择提取时间为l.Oh，因此，本试验最理想的提取方案是，即乙醇体积分数是60%，料液比是1：40，回流提取时间是1.0 h，此时提取效果最佳。2.4.2验证试验精密称取满山香药材粉末3份，每份约1.0 g，置于锥形瓶中，测定其总黄酮含量，结果（表5）表明，采用正交试验优化的工艺提取满山香药材总黄酮，其含量平均值为23.53 mg/g，/^D為1.94%〇

3小结与讨论

本试验以满山香药材为研究对象，考察了乙醇体积分数、提取液体积和提取时间3个影响因素，瑶药满山香总黄酮的提取采用回流提取法，利用正交试验的方法优化瑶药满山香总黄酮的最佳提取工艺。前期研究发现，影响瑶药满山香总黄酮提取工艺的主要因素是溶剂体积分数、提取液体积和提取时间，根据试验影响因素的选择与确定，本试验采用L9（34）正交试验设计的方法，进行多次试验，结果分析表明，瑶药满山香的最佳提取工艺，即采用回流提取法，乙醇体积分数为60%，料液比为1：40，提取时间为1.0 h，此时瑶药满山香总黄酮提取效果最佳。

在单因素试验的基础上，通过正交试验，建立了满山香总黄酮提取率的工艺优化。方差分析表明，乙醇体积分数、料液比2个因子具有显著性，各因子对总黄酮含量影响的大小依次为料液比（B）>乙醇体积分数（A）>提取时间（C）。

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收稿日期：2019-11-15

基金项目：国家自然科学基金项目（81360524） ;2019年度广西高校中青年教师科研基础能力提升项目（2019KY0341）;广西中医药大学青年基金项目（2019QN036）;广西然科学基金项目（2014GXNSFAA118208）;国家中医药管理局科研三级实验室中（壮）药化学与质量分析实验室（国中医药发2009[21]号）

作者简介：唐春丽（1980-），女，广西桂平人，副主任药师，硕士，主要从事中药质量分析及其药效机制研究，（电话）18978913964（电子信箱）12072982891@qq.com;通信作者，魏江存，药师，硕士，主要从事中药、民族药及其制剂质量分析和药效机制研究，（电子信箱）960837714@qq.com。