鸭疫里默氏杆菌和副粘病毒混合感染的诊断

罗玲　李丽　汪宏才　温国元　罗青平　王红琳　卢琴　商雨　邵华斌　王孝忠

摘要：2019年7月，湖北省某养殖场饲养的10 000只鸭暴发疫病，引起大量死亡，经实验室细菌学诊断和病毒学诊断，确诊为鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer）和副粘病毒混合感染。

关键词：鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer）;副粘病毒;混合感染;诊断

中图分类号：S855.3 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020） 16-0115-03

DOI： 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.025

鸭疫里默氏杆菌病是危害全世界养鸭业一种重要的水禽细菌性疾病，是由鸭疫里默氏杆菌（Rieme-rella anatipestifer）引起家鸭、火鸡、鹅和其他禽类的一种接触性传染病，又名鸭传染性浆膜炎。该病呈急性或慢性败血症形式，其特征是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪性输卵管炎等，发病率和死亡率很高，易产生耐药性，且血清型众多，给该病的防治工作带来很大困难，已对养鸭业造成了巨大的经济损失[1]。鸭副粘病毒病是危害全世界养鸭业的一种重要病毒病，没有明显的流行季节，发病后病鸭并非立即死亡，而是混合或继发感染其他病毒病或细菌病，使鸭群的病情加重，造成重大的经济损失。近年来，养殖场病毒病混合或继发感染细菌病已成普遍现象，增加了疾病诊断和防控难度。

2019年7月，湖北省某养殖场饲养的10000只麻鸭暴发疫病，引起大量死亡，发病后经实验室诊断，确诊为鸭疫里默氏杆菌和副粘病毒混合感染，经治疗病情得到了控制。现将病鸭群的疾病诊断及防治情况报道如下。

1发病情况

该养殖户为个体养殖户，共饲养10000只地方麻鸭，圈养，2019年7月初鸭群突然发病，发病时鸭只25日龄，发病后立即投喂氟苯尼考和阿莫西林等药物后无明显效果，每天死亡200多只。

2 临床症状

发病鸭群精神萎靡，食欲下降或不食，共济失调，粪便呈水样，泄殖腔周围被粪便污染，部分病鸭出现头颈歪斜等神经症状，部分鸭出现张口呼吸、甩头等呼吸道症状。

3病理剖检

送检鸭主要剖检病变是心包和肝脏表面均覆盖一层灰白色的纤维素膜，气囊有纤维素渗出性炎症，肾脏肿大并有尿酸盐沉积，部分鸭腺胃出血、脑出血和充血，其他组织无肉眼可见病变。

4实验室诊断

4.1 细菌学诊断

1） 细菌分离培养。无菌采集病鸭的脑组织直接划线接种于含5%小牛血清的TSA培养基上，置于烛缸中37 ℃培养24～48 h，挑取圆形隆起、光滑的菌落接种于含5%小牛血清的TSA、麦康凯琼脂平板和TSB培养基，烛缸中37 ℃培养24～48 h，观察培养结果，染色、镜检。

2） 生化试验。将临床分离菌的TSB纯培养物分别接种到葡萄糖、蔗糖、棉子糖、吲哚、硫化氢、硝酸盐、M.R、V-P、明胶液化和触酶10种生化管进行生化试验。

3） 药敏试验。选择头孢吡肟、头孢西丁、头孢噻吩、头孢噻肟、阿米卡星、萘啶酸、环丙沙星、恩诺沙星、依诺沙星、左氟沙星、氟苯尼考、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿莫西林15种抗生素进行药敏试验，试验方法按照世界卫生组织（WHO）推荐的Kirby-Baure法进行[2]。

4） PCR扩增鉴定。针对鸭疫里默氏杆菌camp基因设计合成引物，引物序列如下：上游引物5'-CTAGGATCCGTAAGTGGTGGGCATACA-3'，下游引物 5'-TCGAAGCTTATCTTGCAGTAGCCGTTG-3'，扩增片段长度为610 bp。PCR反应体系和反应条件按照罗玲等[3，4]方法进行。将37℃培养的临床分离菌株进行PCR鉴定，PCR阳性产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

4.2病毒学诊断

1） 病料处理。无菌采集病鸭的肺脏和气管等组织1g于2mL离心管中，加入含1%双抗的PBS溶液，组织匀浆15 min，反复冻融3次，5 000 r/min离心10 min，取上清备用。

2） 病毒分离。取上述组织上清液接种9～11日龄的鸡胚，收集24 h后死亡鸡胚及5 d后未死亡鸡胚尿囊液。

3） 病毒RNA提取及反转录。取上述处理的组织上清液和鸡胚尿囊液分别提取RNA，并进行反转录PCR。RNA提取方法按照AXYGEN Viral RNAExtraction Kit Ver. 5.0试剂盒说明书进行。反转录体系：反应总体积为20μL，组成如F：5×Hiscript酶5 μL，RNA 模板 8μL，H20 7μL，混匀，55℃作用 15min，85℃ 5s〇

4） 引物设计合成。参考GenBank上已发表的NDV F基因序列设计，上游引物5'-ATGGGCTC-CAGACCTTCTAC-3'，下游引物：5'-ACTGCTAGTT-GCGATAATCCG TCAG-3'，送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成，片段大小为530 bp。

5） RT-PCR扩增鉴定。将获得的cDNA进行PCR，PCR反应总体积为25μL，包括：2×Taq DNA聚合酶 12.5 μL，cDNA 2 μL，两条 PCR 引物各 1 μL，加超纯水8.5μL。反应条件为95℃预变性5 min;95 ℃变性 10 s，55℃ 退火 10 s，72 ℃ 延伸 10 s，35个循环;最后72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，并将PCR阳性产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

5诊断结果

5.1 细菌学检查结果

细菌分离结果：分离菌在TSA中培养24 h后，形成圆形凸起、边缘整齐、透明、有光泽、呈奶油状的小菌落;分离菌在TSB中培养24 h后液体浑浊;分离菌在麦康凯培养基上不生长;分离菌革兰氏染色为阴性、短小杆菌，单个或成双存在，少數呈链状排列。