黄芩苷对老年人骨髓间充质干细胞增殖能力和凋亡水平的影响及机制

翟晓艳，裴 亮，周儒奎，杨 蓉，杨李旺，赵焕新，季新燕，张育敏，储开博

（1.山西中医药大学解剖教研室，山西晋中030619； 2.山西医科大学第二医院泌尿外科，山西太原030001；3.山西中医药大学生理教研室，山西晋中030619）

干细胞是一类具有自我更新和多向分化能力的未分化细胞，在组织修复方面起重要作用。干细胞移植治疗已经被公认为多种疾病的有效治疗方法，例如韧带损伤、骨损伤、软骨损伤和心肌梗死等，然而在老年患者的应用效果欠佳［1］。究其原因，年龄是重要原因之一，年龄可以引起干细胞数量减少以及增殖能力下降、凋亡水平增高——呈现出衰老的表型，影响干细胞的治疗效果［2］。因此，使老年干细胞年轻化、提高干细胞的活性是有效解决老年患者干细胞移植应用的有效途径之一。

有研究报道，黄芩苷可清除活性氧成分、超氧自由基，起到抗氧化的作用，同时对于抗凋亡也有作用［3-4］。而细胞衰老的过程中，活性氧成分和超氧自由基积累增多是重要的原因之一［2］。但是黄芩苷对于老年骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBM-MSCs） 的作用目前还未见报道。本实验拟研究黄芩苷对于老年hBM-MSCs增殖能力和凋亡水平的作用，为改善老年干细胞自体移植治疗提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物与试剂 黄芩苷（西安原生植物技术有限公司，纯度 98%）。Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium（IMDM）细胞培养基、澳洲胎牛血清（Gibco，美国）；0.25%胰酶（索莱宝，中国）；CCK-8试剂盒（Dojindo，日本）；Bcl-2、Bax一抗（Santa Cruz，美国）；ACTB、caspase 3一抗（Cell Signaling Technology，美国）；辣根标记山羊抗兔IgG、辣根标记山羊抗小鼠IgG（北京中杉，中国）；高灵敏度化学发光（ECL）检测试剂盒（汉恒生物科技，中国）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国）；DUB00型核酸蛋白分析仪（Beckman Coulter公司，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 老年hBM-MSCs的培养 取自山西医科大学第一、二附属医院血液科（排除恶性肿瘤）8例老年患者骨髓，55～81岁，平均年龄（63.23±2.71）岁。本研究已经通过山西中医药大学伦理委员会审查（批件号2019LL186），受试者均签署知情同意书。获得骨髓后，将新鲜的骨髓1 mL中加入10 mL含有10%FBS IMDM培养基中，接种到100 mm2的培养皿中，48 h后换液培养，待细胞达到80～90%融合时，将细胞以5000细胞/cm2的密度传代。本实验中所用的细胞均为P4代细胞。

1.2.2 CCK-8法检测黄芩苷的细胞毒性 本实验用CCK-8试剂盒检测黄芩苷对老年hBM-MSCs的细胞毒性作用。将老年hBM-MSCs分为8个浓度，每个浓度 3个复孔（分别为0 μM/L、0.5 μM/L、1 μM/L、10 μM/L、50 μM/L、100 μM/L、500 μM/L、1000 μM/L）以1000细胞/孔的密度分别接种到96孔板中，加入含10%FBS IMDM培养基中贴壁过夜后，换液为不同浓度黄芩苷（0、0.5、1、10、50、100、500、1000μM/L）+10%FBSIMDM培养基，37℃、5%CO2培养箱中培养3 d后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，在37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h，用酶标仪测定450 nm波长处的吸光值（A值），每例细胞3个复孔，取均值代表细胞毒性，参比波长为600 nm。

1.2.3 细胞计数法检测细胞的增殖能力 将老年hBM-MSCs分为4个浓度，每个浓度8例细胞，每例细胞每个浓度3个复孔（分别为0 μM/L、0.5μM/L、1 μM/L、10 μM/L） 以 7000 细胞/孔的密度接种到12孔板中，分别加入黄芩苷浓度为0、0.5、1、10 μM/L 的 10%FBS IMDM 培养基，在培养 0、2、4、6、8 d 后，用 0.25%胰酶消化后计数细胞。

1.2.4 Annexin-V和PI染色法检测细胞的凋亡水平 将老年hBM-MSCs分为两组（对照组和黄芩苷组，每组8例细胞，每例细胞3个复孔），将细胞以 105/mL 的密度接种，分别加入含 0 μM/L、1 μM/L黄芩苷的培养基，在细胞培养至6 d时，收集细胞用 1000 μM H2O2处理 6 h，用 Annexin-V 和 PI染色（Life Technologies），流式细胞仪检测细胞凋亡水平，凋亡细胞为Annexin-V阳性细胞。

1.2.5 Western免疫印迹法检测Bax、Bcl-2和caspase 3蛋白相对水平的表达 将老年hBM-MSCs分为两组（对照组和黄芩苷组，每组8例细胞，每例细胞3个复孔），将细胞以1×105/mL的密度接种，分别加入含 0 μM/L、1 μM/L 黄芩苷的培养基，在细胞培养至6 d时，收集细胞用1000 μM/L H2O2处理6 h后，用RIPA蛋白裂解液提取对照组和黄芩苷组细胞的总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，取30 μL蛋白经12%SDS凝胶电泳后，转移至PVDF膜上，加5%脱脂牛奶4℃封闭过夜后，分别加入一抗兔抗人 Bax（1∶200）、一抗兔抗人Bcl-2（1∶200）、一抗兔抗人 cleaved caspase 3（1∶1000）、一抗鼠抗人 ACTB（1∶1000），4 ℃过夜孵育，加入1∶2000辣根过氧化物酶标记的二抗，最后加入ECL显影液，用图像分析系统采图，Image J软件以ACTB为内参分析相对灰度值，蛋白相对表达水平=目标蛋白灰度值/ACTB灰度值。

1.2.6 SOD和MDA含量的测定 将以上1.2.5处理的细胞用细胞刮收集，清洗离心后超声粉碎，12 000 r/min离心10 min，收集上清液，按照超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒和丙二醛（MDA）检测试剂盒说明书检测SOD和MDA的含量。

1.3 统计学方法

所有数据均用统计软件使用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。实验数据均为计量资料，以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t-test检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芩苷的细胞毒性

本实验用CCK-8法检测黄芩苷对老年hBM-MSCs的细胞毒性。用不同浓度的黄芩苷（0.1-1000 μM/L）处理老年 hBM-MSCs。从实验中观察到，当用含有 0.5、1、10 μM/L 黄芩苷的IMDM培养基培养人骨髓间充质干细胞3 d时呈现最小细胞毒性。而在培养基中黄芩苷浓度大于50 μM/L时，细胞的存活率与对照组比较（IMDM培养基中黄芩苷浓度为0 μM/L）均明显下降（P＜0.01），出现明显细胞毒性表现（图1）。因此黄芩苷对干细胞增殖能力实验中所用黄芩苷浓度为0.5、1、10 μM/L。

图1 黄芩苷（baicalin）对老年hBM-MSCs的细胞毒性

2.2 黄芩苷对老年hBM-MSCs增殖能力的影响

本实验通过计数法研究发现（图2）：与对照组（0 μM/L）比较，在第 2天和第 4天，3个不同浓度黄芩苷组老年hBM-MSCs的数量没有显著差异，但是在第6天和第8天则数量显著增多（P＜0.01）。这说明黄芩苷能提高老年hBM-MSCs的增殖能力。其中1 μM/L和10 μM/L黄芩苷对骨髓间充质干细胞的增殖能力影响较0.5 μM/L黄芩苷的作用更大（P＜0.05）。而 1 μM/L 和 10 μM/L 两组黄芩处理组之间并无显著差异。因此以下实验中所用的黄芩苷的浓度均为1 μM/L。

图2 黄芩苷（baicalin）对老年hBM-MSCs增殖能力的影响

2.3 黄芩苷对老年hBM-MSCs凋亡水平的影响

空白组老年hBM-MSCs的凋亡率（Annexin-V阳性细胞率）为（30.4±4.43）%，黄芩苷组凋亡率（24.9±2.68）%，黄芩苷组的凋亡水平显著低于对照组（P＜0.01），这说明黄芩苷对老年hBM-MSCs具有抗凋亡的作用。结果见图3。

通过Western印迹法对凋亡相关蛋白的检测发现（图4，表1），与对照组比较，黄芩苷组clesved caspase 3（caspase 3的裂解产物）和促凋亡蛋白Bax蛋白水平表达下降，而抑制凋亡蛋白Bcl-2表达增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 黄芩苷对老年hBM-MSCs凋亡相关蛋白Bax、caspase 3和Bcl-2蛋白表达水平的影响 （±s）

表1 黄芩苷对老年hBM-MSCs凋亡相关蛋白Bax、caspase 3和Bcl-2蛋白表达水平的影响 （±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05

Group n Bax Cleaved caspase 3 Bcl-2 Control group 8 1.204±0.214 0.375±0.012 0.734±0.291 Baicalin group 8 0.433±0.1051） 0.122±0.0331） 1.539±0.2391）

2.4 黄芩苷对老年hBM-MSCs中SOD和MDA含量的影响

图3 黄芩苷对老年hBM-MSCs凋亡水平的影响

图4 黄芩苷对老年hBM-MSCs凋亡相关蛋白Bax、caspase 3和Bcl-2蛋白表达水平的影响

与对照组比较，超氧化物歧化酶（SOD）的含量显著增高（P＜0.05），而丙二醛的含量则显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表2。

表2 黄芩苷对老年hBM-MSCs中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的影响（±s）

表2 黄芩苷对老年hBM-MSCs中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的影响（±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05

Group n SOD（U/mg） MDA（nmol/mg）Control group 8 72.30±14.32 5.05±1.09 Baicalin group 8 97.86± 0.1051） 2.94±0.831）

3 讨论

骨髓间充质干细胞由于其来源丰富、取材方便、低免疫性等优势成为干细胞最主要的来源之一。研究发现，随着年龄的增长，hBM-MSCs呈现出衰老的表型，增殖能力和抗氧化应激能力均下降，凋亡水平升高。因此老年hBM-MSCs自体移植的应用在很多领域受到了局限［3，5］。随着全球人口老龄化时代的到来，如何使老年hBM-MSCs更加年轻化，使其增殖能力和抗氧化应激能力提高、凋亡水平下降，从而提高修复能力、改善老年hBMMSCs自体移植治疗效果日益重要。

黄芩（baicalin，C21H18O11），别名黄芩苷，化学名为5，6-二羟基-7-O-葡萄糖醛酸黄酮苷，是从黄芩根中提取出来的一种黄酮类化合物，具有广泛的生物活性，并且毒性低、安全范围广，药物来源方便且丰富（黄芩为山西的道地药材之一），具有广阔的发展前景。大量的研究发现：黄芩苷具有抗氧化应激的作用，黄芩苷在结肠炎、镉诱导的肝细胞毒性、缺血-再灌注后的心肌损伤和脑外伤的应用中均表现出保护作用，而这些保护作用都是通过抗氧化应激作用来实现的［3-4，6-7］。氧化应激是引起细胞衰老过程中的关键步骤之一［2］，但是目前对于黄芩苷对hBM-MSCs的作用国内外还未见报道。本研究以黄芩苷为靶点，探讨使老年hBM-MSCs年轻化的方法。本研究结果发现：将1 μM/L的黄芩苷作用于H2O2诱导的老年hBMMSCs，使脂质过氧化物MDA表达下降，过氧化物歧化酶 SOD 表达升高，与研究报道一致［3-4，6-7］。因此我们得出结论：黄芩苷对老年hBM-MSCs具有抗氧化应激作用，黄芩苷可能是老年hBM-MSCs年轻化的靶点。

本研究首先进行黄芩苷对老年hBM-MSCs的毒性作用实验，结果表明，当用含有 0.5、1、10 μM/L黄芩苷的IMDM培养基培养老年hBM-MSCs时呈现最小细胞毒性。因此本研究在做细胞增殖实验时，分别用0.5、1、10 μM/L的黄芩苷作用于老年hBM-MSCs，结果发现：黄芩苷可以促进老年hBM-MSCs的增殖能力。1、10 μM/L的黄芩苷作用于老年hBM-MSCs，其增殖能力高于0.5 μM/L。而1 μM/L与10 μM/L黄芩苷作用于老年hBMMSCs，其增殖能力没有显著差异，因此将1 μM/L的黄芩苷作为最适浓度。Zuo Wenpu等［8］研究发现黄芩苷对于施万细胞有促进其增殖能力的作用。李蓉等［9-10］研究发现黄芩苷可以促进大鼠海马神经干细胞的增殖，从而改善缺血再灌注损伤后的认知和记忆功能的障碍。但是也有部分研究与本研究结果相反，Wang Jian等［11］发现黄芩苷通过抑制miR-294的表达抑制小鼠胚胎干细胞的增殖。通过对比分析发现：上述研究黄芩苷浓度均在100 μM/L以上，远远高于本实验中所使用的浓度，这可能是产生结果不一致的原因之一，也有可能是细胞种类的不同、实验条件的不同等，但这些都有待进一步的研究证实。

Fang Jiang等［3］研究发现黄芩苷具有抗凋亡的作用：于脑外伤的小鼠腹腔注射黄芩苷后，全脑凋亡阳性细胞减少，同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，促凋亡蛋白Bax和caspase 3表达下降。Yao Jun等［4］发现黄芩苷作用于结肠炎大鼠模型，可以使结肠上皮细胞凋亡阳性细胞减少，同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，促凋亡蛋白Bax和TGF-β表达下降。本研究结果证实：黄芩苷作用于老年hBM-MSCs后，凋亡细胞阳性率下降，同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，促凋亡蛋白Bax和caspase 3表达下降。

综上所述，黄芩苷具有促进老年hBM-MSCs呈现出年轻化的表现，即增殖能力增强，凋亡水平下降，而这些作用可能是通过修复抗氧化应激能力实现的，本研究为改善老年干细胞自体移植治疗效果提供了实验基础。