酱油中产气代表性微生物的筛选和检测方法的建立

张洁

摘 要：本文分析酱油产气的诱发原因，筛选出酱油样本中的产气微生物，通过模拟胀袋环境，找出可疑菌株并进行产气验证。采用RCM进行目标菌培养，在pH=7.5、37 ℃厌氧条件下培养18 h，最终检出引发酱油产气的代表性微生物丁酸梭菌，且该检测方法灵敏度较高、准确性强。

关键词：酱油产气;代表性微生物;微生物筛选

Abstract：This paper analyzes the causes of soy sauce gas production， comprehensively screens microorganisms in soy sauce samples， and finds out suspicious strains and conducts gas production verification by simulating the swelling environment. The target bacteria were cultured by RCM， and cultured under anaerobic conditions at pH=7.5 and 37 ℃ for 18 h. Finally， the representative microorganism Clostridium butyricum which caused soy sauce gas production was determined， and the detection method was proved to be highly sensitive and accurate.

Key words：Soy sauce gas production; Representative microorganisms; Microorganism screening

中圖分类号：TS264.2

酱油酿造是我国食品工业的重要构成部分，产品存放过程中胀袋（瓶）、渗漏问题普遍存在，导致产品品质降低并引发食品安全风险，可能对生产企业经济效益获取及市场口碑造成不利影响。为有效避免上述问题，需要通过实验分析，找出酱油胀袋（瓶）的诱发机理，为酱油产品质量控制方案制定提供理论依据。

1 酱油产气机理分析

研究表明，酱油产气机理非常复杂，酱油胀袋（瓶）的原因可大致分为3种：①物理原因，如热胀冷缩。②化学原因，如酸碱反应。③生物原因，如微生物产气。以上3种原因中，生物原因被大多数学者所认可，主要是由于酱油产品采用微生物发酵的方式生产，其所处环境中微生物组成非常复杂，目前行业采用巴氏法进行灭菌，很难将酱油内微生物完全灭除。酱油成品中微生物的来源：①灌装灭菌前空气、设备系统内存在的耐热菌。②原材料中的微生物，如乳酸菌、酵母菌等[1]。

2 酱油产气代表性微生物筛选与检测

2.1 产气微生物鉴定

2.1.1 样本采集

实验用酱油样本来自某厂同一生产线同批次生产的高盐稀态三级酱油产品，包括正常酱油和产气酱油。

2.1.2 微生物分离

微生物分离在无菌条件下进行，将产气样本充分摇匀后，取25 mL样本加入到225 mL无菌生理盐水当中，得到10倍稀释液。分别取100和10-1两稀释度样本0.1 mL均匀涂抹在对应培养基上，其中，细菌分离采用营养琼脂，培养条件为36 ℃、48 h;霉菌、酵母菌分离采用孟加拉红培养基，培养条件为28 ℃、5 d;厌氧菌分离采用MRS培养基，培养条件为36 ℃、72 h。

各稀释度均设置2组平行实验和1组空白对照，形态不同菌株在培养基内反复纯化2～3次，纯化菌种经标记后放置于甘油管内，在-80 ℃条件下冷冻保存。

最终，产气酱油样本内未分离出酵母菌和霉菌，营养琼脂和MRS培养基中分别分离出部分细菌和厌氧菌。样本稀释梯度为100时，实验分离出的细菌菌落数量较多、分布密集且黏连现象严重，因形态辨别困难，无法进行产气菌分离。样本稀释梯度为10-1时，分离出细菌相对分散、数量适中、便于观察，可用于产气菌分离。使用革兰氏染色显微镜观察菌体形态，合并相似菌株，完成菌株初步筛选，最终对营养琼脂培养基中的8株菌株（编号N1～8）和MRS培养基中分离出的1株菌株（编号M1）继续做纯化处理。

2.1.3 微生物验证

在相应培养基上刮取已编号纯化微生物新鲜菌苔，放入无菌生理盐水中，制成103 CFU·mL-1的菌悬液。取0.1 mL菌悬液添加至产气验证培养基当中分别培养，观察导管内气泡生成情况，判断是否为产气微生物。如表1产气验证结果。

验证发现，N1～8菌株在14 d内均未产气，M1菌株的3支试管在7 d后产生一定气量，14 d后产气量明显增加。而阳性对照组和厌氧培养下阳性对照组的3支试管均发生产气现象，14 d的产气量要高于7 d，且厌氧培养下阳性对照组的产气现象更为明显[2]。由此可以确定M1菌株为导致酱油产气的微生物。

2.1.4 产气微生物的鉴定方法

常规法。①细菌。观察细菌菌落形态、大小、芽孢染色等情况，进行生理特性及生化反应试验。②酵母菌。观察菌落特征，进行染色试验和生理生化试验。③霉菌。观察菌落形态及特征。

VITEK2 Compact法。向一次性试管内添加3 mL无菌生理盐水，使用消毒棉签沾取单一菌落配制菌悬液，浊度达到0.6～0.7后，停止搅拌，放入填充仓进行测试。

飞行时间质谱法。取纯化和产气验证后的菌落，将新鲜菌落直接涂抹在MALDI靶板上，使其自然干燥。然后在菌层上添加1 ?L70%的甲酸水溶液，自然干燥后再添加1 ?L基质溶液，干燥后进行质谱分析。

显微镜观察中发现，M1菌株呈现短杆形态，单个或成对出现，革兰氏染色为阳性。按照《伯杰细菌鉴定手册》中要求，对M1菌株做过氧化氢酶、硝酸盐还原等试验，观察菌体变化情况。试验结果如表2所示。