单疱病毒性角膜炎患儿泪液MMP-2、MMP-9表达与预后复发相关性研究

索倩 张德勇 郭宝 孙莉 张波 陈艺林 蔡文茜

因抗生素的应用，细菌性角膜炎已得到有效控制，目前眼科常见角膜炎多为病毒性，特别是单疱病毒性角膜炎[1]。单疱病毒性角膜炎主要分为感染性角膜炎、神经营养性角膜炎、基质型角膜炎、内皮型角膜炎4种类型，它是常见的危害视力的病毒性眼病，其患病率和致盲率均占角膜病首位，且具有较高的复发率[2，3]。因此，临床上急需寻找单疱病毒性角膜炎预后相关因子，以便及时预测、合理治疗，降低疾病复发率。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是一类锌蛋白酶，可分解细胞外基质组分，在有机体生长发育中逆转和重塑，且在疾病的病理损害中起着重要的作用[4]。有报道表明，MMP-2、MMP-9等多种MMPs在翼状胬肉中表达增高，高表达的MMPs 溶解鲍曼氏层，使翼状胬肉血管化侵袭角膜[5]。Schargus等[6]探讨和评价了MMP-9的测定对干眼症及其亚型的诊断价值。各报道均表明MMP-2、MMP-9与眼部疾病有密切联系，但很少有二者在单疱病毒性角膜炎中的相关报道。因此，本研究通过检测单疱病毒性角膜炎患儿泪液中MMP-2、MMP-9表达水平，探讨MMP-2、MMP-9在预测单疱病毒性角膜炎患儿预后复发中的应用价值。以期为开发单疱病毒性角膜炎预后复发预测指标开辟新思路，同时配合积极治疗降低复发率。

资料与方法

一、一般资料

选取2016年5月至2018年6月于本院接受治疗的80例单疱病毒性角膜炎患儿(包括感染性角膜炎28例、神经营养性角膜炎22例、基质型角膜炎16例、内皮型角膜炎14例)为研究对象(角膜炎组)，其中右眼32例，左眼37例，双眼11例，共91只眼，年龄1～11岁，平均(6.17±2.06)岁；男性43例，女性37例；同期选取76例(76只眼)因泪液分泌过多行泪液检查未发生角膜炎儿童作为对照(对照组)，年龄1～10岁，平均(5.82±1.83)岁；男性39例，女性37例。两组儿童年龄、性别资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。80例单疱病毒性角膜炎患儿根据各自病理分型及病情程度采取不同治疗方法，最终均治愈，自觉症状消失，视力提高，但其中30例在随访1年内出现复发，根据病情有无复发将单疱病毒性角膜炎患儿分为复发组和未复发组。本研究中所有患儿均由主治医师明确诊断，本试验经医院临床研究伦理委员会批准，符合伦理学标准，所有受试对象家人均由专业人员详细告知研究内容并自愿参加，同时签署知情同意书。

纳入标准：①患儿病情均符合角膜炎诊断标准[7]，由临床症状判断、实验室病原学检查等确诊，单疱病毒性角膜炎分类参照Holland等提出的分类法[8]；②随访完成；③无其它眼部疾病者；④病理资料齐全者。排除标准：①有严重认知功能障碍患儿；②伴有全身系统性疾病与恶性肿瘤患儿；③过敏性体质或合并严重中性粒细胞减少患儿；④其它因素所致难以顺利完成本研究患儿。

二、主要试剂与仪器

MMP-2 ELISA试剂盒(货号：HH-32-1)，购自上海传秋生物科技有限公司；MMP-9 ELISA试剂盒(货号：ARB11575)，购自北京百奥莱博科技有限公司。PT-3502C型全波长酶标仪，购自北京普天新桥技术有限公司。

三、研究方法

1.样品采集及保存：所有受试对象均于下午2～4时收集泪液。使用20 μl微量吸管于下穹隆部取结膜囊内泪液60～100 μl，置于0.5 ml塑料管中(经去离子水处理)，加热后封闭管口，置于～20℃保存待测。

2.泪液中MMP-2、MMP-9水平测定：采用酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测泪液中MMP-2、MMP-9水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

四、统计学分析

结 果

一、两组泪液中MMP-2、MMP-9水平比较

角膜炎组泪液中MMP-2、MMP-9水平显著高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组泪液中MMP-2、MMP-9水平比较

二、不同类型角膜炎患者泪液中MMP-2、MMP-9水平比较

各角膜炎患者泪液中MMP-2、MMP-9水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各角膜炎患者泪液中MMP-2、MMP-9水平比较

三、治疗后复发患儿与未复发患儿泪液MMP-2、MMP-9水平比较

复发组泪液中MMP-2、MMP-9水平显著高于未复发组(P<0.05)。见表3。

表3 治疗后复发患儿与未复发患儿MMP-2、MMP-9水平比较

四、单疱病毒性角膜炎患儿治疗后复发患儿泪液MMP-2、MMP-9水平相关性

Pearson法分析单疱病毒性角膜炎患儿治疗后复发患儿泪液中MMP-2、MMP-9水平的相关性，结果显示，MMP-2、MMP-9水平呈正相关(r=0.675，P<0.05)。见图1。

五、泪液MMP-2、MMP-9对单疱病毒性角膜炎治疗后复发的诊断价值

分别以泪液MMP-2、MMP-9单个指标及二者联合预测值为检验变量绘制ROC曲线，结果显示，泪液MMP-2、MMP-9诊断单疱病毒性角膜炎治疗后复发的曲线下面积(area under curve，AUC)分别为0.788(95%CI:0.677～0.899)、0.873(95%CI:0.785～0.961)，截断值分别为0.714 ng/ml、1.081 mg/l，特异性分别为88.0%、82.0%，敏感度分别为66.7%、83.3%；二者联合诊断单疱病毒性角膜炎治疗后复发的AUC为0.916(95%CI:0.835～0.997)，特异性为90.0%，敏感度为83.3%。见图2。

讨 论

单纯疱疹病毒角膜炎的感染一般分为两种形式：原发性感染和复发性感染，其中原发性感染多见于基本无免疫力的儿童，复发性感染多见于血清中已有中和抗体、曾有过病毒感染者[9]。单疱病毒性角膜炎起病急、病程长，对视力损害较大，是临床中常见致盲性眼部疾病。治疗后反复发作是单疱病毒性角膜炎致盲的主要原因，也是目前临床医师研究的重难点问题，而有关单疱病毒性角膜炎复发的具体机制仍不十分清楚，且缺乏特异性诊断标准[10]。因此，临床上急需寻找单疱病毒性角膜炎复发相关标准，以便为临床治疗提供指导意见。

MMP家族包括MMP及其抑制剂，其中MMP是一组蛋白水解酶，可降解细胞外基质，其抑制剂可抑制其活性[11]。细胞外基质MMP诱导因子在人类各种肿瘤细胞中广泛存在，主要作用为刺激与肿瘤有关的成纤维细胞合成增加[12]。MMP与视网膜母细胞瘤、葡萄膜黑色素瘤等眼肿瘤的发生、发展及浸润转移有密切联系[13]。MMPs根据作用底物不同，可以分为五种亚型：明胶酶(MMP-2，MMP-9)、膜型MMPs(MMP-14，MMP-15，MMP-16)、胶原酶(MMP-1，MMP-8，MMP-13)、基质溶解素(MMP-3，MMP-10)及其他类MMPs(MMP-12，MMP-19，MMP-20)[14]。胶原酶切除外源酶后，MMP-2，MMP-9在降解纤维性胶原过程中发挥关键作用，此外，MMP-2，MMP-9可降解层黏连蛋白、纤维黏连蛋白、弹性蛋白及各种胶原等[15]。本研究结果显示，角膜炎组泪液中MMP-2、MMP-9水平显著高于对照组。提示MMP-2、MMP-9的高表达可能与单疱病毒性角膜炎病情的发生密切相关。而研究表明，角膜炎中MMP-2、MMP-9的表达，可能是由于病毒大量复制、中性粒细胞浸润，而浸润的中性粒细胞、巨噬细胞等可产生MMPs[16]。李晓娜等[17]通过机械牵拉实验显著增加炎性因子及MMP-9蛋白表达证明力学刺激可能通过释放炎性因子，进而上调MMP-9表达，促进圆锥角膜的发生和发展。复发组泪液中MMP-2、MMP-9水平显著高于未复发组。提示MMP-2、MMP-9水平可能除了参与单疱病毒性角膜炎原发性感染，有可能还参与其复发性感染，MMP-2、MMP-9表达水平的检测有望成为疾病复发早期诊断的重要指标。Pearson法分析结果显示，单疱病毒性角膜炎患儿治疗后复发患儿泪液中MMP-2、MMP-9水平呈正相关。提示MMP-2、MMP-9可能通过高表达，共同参与角膜再次感染单疱病毒，与病情复发关系密切。泪液MMP-2、MMP-9诊断单疱病毒性角膜炎治疗后复发的AUC分别为0.788、0.873，特异性分别为88.0%、82.0%，敏感度分别为66.7%、83.3%。提示二者可能对于单疱病毒性角膜炎复发均有一定的诊断价值，且MMP-2诊断特异性更高，MMP-9诊断敏感度更高。二者诊断截断值分别为0.714 ng/ml、1.081 mg/l，提示MMP-2水平稳定在0.714 ng/ml以下，MMP-9水平稳定在1.081 mg/l以下时，治疗后的单疱病毒性角膜炎患儿病情控制稳定，无复发倾向。二者联合诊断单疱病毒性角膜炎治疗后复发的AUC为0.916(95%CI:0.835～0.997)，特异性为90.0%，敏感度为83.3%。提示二者联合检测可能对于诊断病情复发的价值更大，临床中可通过密切监测二者水平变化，指导治疗和预后，降低复发率。

综上所述，MMP-2、MMP-9在单疱病毒性角膜炎复发患儿泪液中呈高表达，其水平变化可能与病情复发密切相关，对于单疱病毒性角膜炎患儿复发的预防及临床治疗可提供指导意见。分析泪液MMP-2、MMP-9水平作为复发诊断指标的优势主要有：泪液取材方便，对于患者配合度要求不高；该方法不受病灶形态影响，可定量检测。但如何将泪液MMP-2、MMP-9水平检测准确、有效地应用到临床诊断单疱病毒性角膜炎复发中，仍需进一步深入探究。