江苏某肉鸡屠宰场弯曲菌耐药性及aadE-sat4-aphA-3耐药基因簇分布分析

张小燕，周 倩，唐梦君，蒲俊华，张 静，陈大伟，陆俊贤，高玉时

（江苏省家禽科学研究所，江苏 扬州 225125）

弯曲菌（Campylobacter）尤其是空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni，C. jejuni）和结肠弯曲菌（Campylobacter coli，C.coli）是世界范围内最重要的人兽共患食源性病原菌[1]。人感染弯曲菌的临床表现主要为腹泻、发热、头痛或伴有呕吐症状，空肠弯曲菌感染也可能导致一些自身免疫性疾病如格林巴利综合征和米勒费歇综合征[2]。多位点序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）研究结果表明家禽是人感染弯曲菌的最重要来源[3-4]。鸡肠道内弯曲菌定殖量可高达8.6log cfu/g，并保持这种感染状态直至屠宰[5-6]，容易造成屠宰、加工及零售环节禽肉及其产品的污染。

近年来，人医临床用药和畜牧业抗菌药物的大量使用甚至是滥用对包括弯曲菌在内的病原菌产生了选择性压力，促进耐药弯曲菌的产生和流行[7]。

对于弯曲菌引发的肠胃疾病如腹泻、便血等首选氟喹诺酮类和大环内酯类抗菌药物治疗，而当发生全身性感染如菌血症时，氨基糖苷类（尤其是庆大霉素）则是最佳治疗药物[8]。氨基糖苷类抗生素在畜禽养殖过程中的不规范使用造成了该类抗生素耐药弯曲菌甚至多重耐药弯曲菌的产生和传播，致使我国弯曲菌多重耐药情况严重[9]。为了解肉鸡屠宰场弯曲菌耐药性及氨基糖苷耐药基因簇aadE-sat4-aphA-3 的分布特点，本研究对江苏某肉鸡屠宰场弯曲菌分离株进行耐药性分析，采用PCR检测aadE-sat4-aphA-3 耐药基因簇分布情况，并检测部分该基因簇阳性菌株对氨基糖苷类药物的MIC值，以期为弯曲菌氨基糖苷类药物耐药机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌 株117 株弯曲菌分离自江苏某一肉鸡屠宰场加工生产链采集的3 批次样品（泄殖腔棉拭、脱毛后胴体、开膛后胴体、消毒后胴体、成品鸡及操作台面和操作人员手套擦拭样品），该3 批次样品中的肉鸡样品来自江苏省3 个不同的养殖场，时间分别为2017 年4 月（39 株）、8 月（38 株）和11 月（40株）。质控菌为空肠弯曲菌标准菌株（ATCC33560）购自中国微生物菌种保藏中心。

1.2 主要试剂弯曲菌CCDA 琼脂培养基、MH 培养基、BHI 培养基等均购自OXOID 公司；脱纤维绵羊全血购自青岛海博生物技术有限公司；9 大类26 种畜禽养殖常用抗菌药物药敏纸片均购自OXOID公司；卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星、链霉素、庆大霉素等药物均购自博迈德生物（Biomed）制品公司；微生物基因组提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；Buffer、dNTPs、TaqDNA 聚合酶、DNA Marker 均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 分离菌株的药物敏感性试验将117 株分离菌接种于含5%脱纤维羊血的MH 培养基，置42 ℃微需氧条件下培养36 h～48 h 后，制备0.5 麦氏浓度菌悬液。参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐方法对弯曲菌进行9 大类26 种抗生素的药敏试验，本实验结果为中度敏感的菌株均统计为敏感，耐药菌株占比为0 则表示所有受试菌株均对该种药物敏感。

1.4 分离菌株氨基糖苷类耐药基因簇aadE-sat4-aphA-3的检测以提取的分离菌基因组DNA 为模板，参照文献[10]，采用PCR 检测aadE-sat4-aphA-3耐药基因簇，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，并经测序鉴定，对检测结果进行统计分析。

1.5 部分菌株的MIC 值测定采用CLSI 推荐的琼脂稀释法[11]测定弯曲菌对5 种氨基糖苷类抗生素卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、链霉素的敏感性，以空肠弯曲菌ATCC33560作为质控菌株。

2 结果与讨论

2.1 药敏试验结果肉鸡屠宰场3 批次分离的弯曲菌耐药性结果显示，共117 株弯曲菌对链霉素和卡那霉素的耐药菌株占比均为93.2%（109/117），对妥布霉素的耐药菌株占比为80.3%（94/117），对阿米卡星的耐药菌株占比为36.8%（42/117），对庆大霉素的耐药菌株占比为42.7%（50/117），对头孢氨苄的耐药菌株占比为96.6%（113/117），对氟喹诺酮类药物耐药菌株占比均大于89.7%（105/117），大环内酯类药物（59.8%）（70/117）、碳青霉烯类药物（1.7%～17.1%）（2/117～20/117）、氯霉素类药物（10.3%～17.9%）（12/117～21/117）耐药菌株占比相对较低；第1 批次所有分离菌株均对大环内酯类药物（红霉素、阿奇霉素）敏感，但第2、3 批次分离菌株对上述大环内酯类药物耐药的菌株占比均分别为81.6%（31/38）和100%（40/40）；受试的117 株分离菌中除第2 批次的7 株菌不具有多重耐药性（耐3 类及以上药物）外，其它110 株分离菌（94%）均表现出多重耐药性。菌株的耐药类型指该菌株耐药的抗生素种类数与受测的抗生素总数的比值，如测定某一菌株对10 种抗生素的耐药性，如果该菌对其中6 种抗生素均具有耐药性，则该菌株的耐药类型为0.6。本研究117 株分离的弯曲菌耐药类型结果显示，大部分菌株的耐药类型集中于0.7～0.9（图1）。以上结果表明江苏某肉鸡屠宰场分离的弯曲菌对畜禽养殖常用的抗菌药物耐药性较强且存在多重耐药现象。同一批次菌株因其来源于同一养殖场因而具有相似的耐药特性。研究表明弯曲菌感染与季节及温度有很大的相关性[12]。弯曲菌虽然不能使鸡发病，但肉鸡在饲养过程中易感染大肠杆菌、球虫病及呼吸道疾病等，养殖户会根据肉鸡饲养阶段发病规律和外界环境变化等因素制定不同日龄肉鸡的用药程序，因此外界环境如温度和季节不同，养殖场用药可能会存在一定的差异。本研究3 批次样品来源于3 个不同的养殖场，其耐药性的差异可能与不同养殖场的用药差异相关。

图1 分离的弯曲菌耐药类型的统计分析结果Fig.1 Analysis of resistant type of Campylobacter isolates

近年来监测数据显示我国临床分离的弯曲菌对氟喹诺酮耐药的菌株占比在1994 年～2010 年间从50%上升至100%[13]。弯曲菌对多种抗生素耐药情况比较严重，其中对环丙沙星和四环素耐药的食品动物源弯曲菌株占比接近100%，对红霉素耐药的鸡源结肠弯曲菌占比从2008 年～2009 年的48.7%上升至2012 年～2014 年的76.4%，对庆大霉素耐药菌株占比从20%升高至80%，且多重耐药情况严重[9,14]。多重耐药弯曲菌具有通过食品源动物将细菌耐药性传递给人类的风险[15]。本研究结果进一步表明我国弯曲菌耐药的严重性。因此建议畜禽养殖应正确合理用药，避免抗菌药物的滥用尤其是预防性抗菌药物的不合理使用；其次相关部门要进一步加强对弯曲菌耐药性的监测，深入研究其对不同类药物耐药的机理，以便针对耐药菌研发新型抗菌药物。

2.2 分离菌aadE-sat4-aphA-3耐药基因簇的检测结果采用PCR 检测分离的弯曲菌中氨基糖苷类耐药基因簇aadE-sat4-aphA-3。结果显示，共有90 株弯曲菌中扩增到长度约为1 500 bp 的目的片段，对部分菌株PCR 产物测序比对后确定其为氨基糖苷类耐药基因簇aadE-sat4-aphA-3，部分菌株的PCR 扩增结果如图2。该基因簇检出率为76.9%，共有17株空肠弯曲菌，73 株结肠弯曲菌检出该耐药基因簇。结果表明该耐药基因簇在肉鸡屠宰场来源的弯曲菌中阳性率较高，可能与分离菌株对氨基糖苷类药物的耐药性有关。

氨基糖苷类耐药基因簇aadE-sat4-aphA-3 于2004 年首次在空肠弯曲菌质粒中发现，目前已陆续报道其在弯曲菌的质粒和染色体中均出现，该耐药基因簇的出现与弯曲菌受多种氨基糖苷类抗生素的选择压力有关[16]。而本研究中aadE-sat4-aphA-3 基因簇阳性率为76.9%，与以往研究结果[10,17-18]相比均较高，这可能与屠宰场3 个批次分离菌株均来自于江苏省有关。

图2 部分分离菌株aadE-sat4-aphA-3 基因簇的PCR 检测结果Fig.2 The detection results of aadE-sat4-aphA-3 in partial isolates by PCR

2.3aadE-sat4-aphA-3阳性弯曲菌MIC 值的测定结果选取20 株aadE-sat4-aphA-3 阳性弯曲菌进行氨基糖苷类5 种抗菌药物敏感性试验。参照文献标准[11]，菌株对庆大霉素、链霉素和妥布霉素的MIC值≥8 μg/mL 为耐药，对卡那霉素和阿米卡星MIC 值≥64 μg/mL 为耐药。结果显示，第1、3 批次所有菌株均对卡那霉素、妥布霉素、链霉素耐药，其中13株该基因簇阳性菌对妥布霉素耐药性较强（MIC 值为512 μg/mL）；第2 批次有2 株菌均对卡那霉素、妥布霉素、链霉素耐药（MIC 值≥128 μg/mL），其余菌株对除卡那霉素外的其余4 种药物均敏感。20 株aadE-sat4-aphA-3 基因簇阳性弯曲菌中共有12 株对庆大霉素耐药，MIC 值最高为256 μg/mL；共有11株菌对受试的5 种氨基糖苷类药物均耐药，且大部分菌株对阿米卡星、妥布霉素的MIC 值≥256 μg/mL（表1）。上述结果表明，aadE-sat4-aphA-3 基因簇阳性弯曲菌对氨基糖苷类药物有较强的耐药性。

表1 20 株aadE-sat4-aphA-3 阳性弯曲菌对氨基糖苷类药物的MIC 值Table 1 MIC value of 20 aadE-sat4-aphA-3 positive strains to aminoglycosides

大环内酯类药物是临床上治疗弯曲菌病的首选药物，但对于弯曲菌引起的重度感染、急性和全身性感染，则需用氨基糖苷类药物（庆大霉素、阿米卡星和链霉素）治疗[19-20]。国内养殖场常利用某些氨基糖苷类药物如阿米卡星和庆大霉素预防和治疗畜禽细菌性疾病，将安普霉素（氨基糖苷类药物）添加于饲料或饮水中用于促进畜禽的生长，这在一定程度上造成氨基糖苷类药物耐药弯曲菌的产生和传播。本研究随机选择的20 株氨基糖苷类耐药基因簇阳性弯曲菌中有11 株对受试的5 种氨基糖苷类药物均耐药，且大部分分离菌对阿米卡星、妥布霉素的MIC 值≥256 μg/mL。提示携带aadE-sat4-aphA-3 基因簇的弯曲菌有可能给公共卫生和人类健康带来一定风险，进一步开展对aadE-sat4-aphA-3 耐药基因簇阳性弯曲菌的监测和传播特点研究很有必要。