制备色谱技术分离纯化天然产物中多酚类化合物的研究进展

夏雅俊，闫维国

(1.兰州石化职业技术学院,甘肃 兰州 730060;2.甘肃省定西市府川镇中心小学,甘肃 定西 744300 )

作为一种绿色、环保、可再生资源，植物多酚的应用涉及了众多领域：(1)医药领域。大量试验表明，植物多酚具有显著的抗氧化作用，同时在抗衰老、抑菌、抗微生物、抗病毒、抗肿瘤以及降血脂含量等方面具有显著功效[1-5]。(2)化工领域。具有"紫外过滤器"之美誉的植物多酚，能够消耗掉由于人体新陈代谢产生的过剩活性氧自由基，抑制体内酷氨酸酶和过氧化氢酶的活性，从而起到美白活肤、祛斑抗皱、延缓衰老的功效[6]。而多酚的抑菌作用则让其能够成为口腔护理剂的理想添加剂。(3)食品领域。植物多酚可以作为食品抗氧化剂以及防腐剂。由于多酚能与蛋白反应，从而可以作为酒或者饮品的澄清剂。同时口服摄入时能，使人产生苦、涩的感觉，将其与甜、酸等味道以一定比例调和后，可以起到调节食物的口感的作用[7]。(4)环保领域。植物多酚是优良的水稳剂，同时还可做为絮凝剂净化污水[8-9]。因其具有与无机金属离子络合的作用，故可将多酚应用与一些土壤重金属离子污染的治理[10]。(5)农牧业领域。植物多酚可用于制螯合肥料、抗病虫害以及抑制土壤酸化[11-13]。

目前，植物多酚主要来源于天然产物，由于多酚类化合物的不稳定性导致了其分离制备存在一定的难度。不同类型的制备色谱技术是分离纯化多酚类化合物的主要手段，为了更好的将其应用在天然产物中植物多酚的分离制备，本章就近年来采用制备色谱进行纯化制备多酚类化合物的方法进行了综述，以期为后期的多酚分离制备提供一定的参考。

2 柱色谱技术在分离纯化天然产物中多酚类化合物的研究进展

自1903年，色谱创始人Svictor首次操作吸附色谱柱以来，已有100多年的历史。随着时代的进步，该领域的技术发展已经趋于成熟，更多的人倾向于应用研究。常规的柱色谱技术有吸附柱色谱、分配柱色谱、离子柱色谱、凝胶色谱、亲和色谱、干柱色谱等，更详细的分类参阅文献[14]。用于分离纯化的主要为硅胶柱、聚酰胺柱、大孔吸附树脂柱等吸附色谱柱技术以及凝胶柱色谱技术。

2.1 硅胶吸附柱色谱技术分离纯化天然产物中多酚类化合物

与其它纯化制备化合物的方法相比，硅胶吸附柱色谱技术有其独特的优点。对挥发性差、沸点高的物质以及热稳定性差的化合物，硅胶柱色谱在其制备和分离中表现出较强优势。部分多酚类化合物对热不稳定，故其分离纯化技术中硅胶柱色谱技术占有一席之地。如王晓飞等[15]采用硅胶吸附色谱柱，将油橄榄叶乙酸乙酯提取物首先以氯仿-甲醇梯度洗脱，得到四个部分，再分别采用分以石油醚-丙酮(8∶2)、氯仿-甲醇(95∶5)、氯仿-甲醇(9∶1)、氯仿-甲醇(85∶15)反复分离重结晶得到15个多酚类化合物，其中1-H-2-苯并吡喃-6,7-二醇、3,4-二羟基苯甲酸、3-羟基-4-甲氧基苯甲酸、异鼠李素、圣草酚、花旗松素是首次从该植物中分离得到。为了研究橄榄油厂废弃物残渣中含有降血糖和抗氧化成分，Hamden等[16]利用硅胶柱色谱对其进行纯化，获得了羟基酪醇、咖啡酸、原儿茶酸、木犀草素、对香豆素芦丁、芹黄素、橄榄苦苷等13个已知的多酚类化合物。这篇文献首次报道了橄榄油废弃物特别是其中的羟基酪醇具有抗氧化应激以及降血糖的作用。

2.2 凝胶柱色谱技术分离纯化天然产物中多酚类化合物

以分子筛效益著称的凝胶柱色谱技术，根据其分离对象的水溶性和脂溶性可将其分为凝胶过滤色谱(GFC)和凝胶渗透色谱(GPC)。多酚类化合物具有一定的水溶性，故通常采用GFC对其进行分离纯化研究，其代表就是葡萄糖(sephadex)系列的凝胶柱色谱。谭和平等[17]利用Sephadex LH-20凝胶柱色谱从茶叶中分离制备得到了茶多酚，主要成分为EGCG，其回收率和纯度均较高。花青素具有不同的聚合态，其化学结构和生物活性常为研究者关注的热点，利用凝胶色谱分子筛的作用进行分离纯化是较理想的选择。通常色谱填料在不同的酸碱条件下，会表现出不同的分离效果。Feng[18]等人从该点出发，处理制得弱酸性阳离子交换凝胶色谱，提高了多酚在凝胶柱上的保留时间，以此实现多酚分离制备。

2.3 聚酰胺吸附柱技术分离纯化天然产物中多酚类化合物

聚酰胺树脂(PA)是由酰胺聚合而成的一类高分子分离材料，它对黄酮类类化合物具有较强的氢键作用[19]。阿曼托双黄酮属于多酚类化合物，是一种天然抗氧化剂。冯志毅[19]采用聚酰胺吸附柱为富集材料，以总黄酮和阿曼托双黄酮的含量以及总黄酮的收率为考察指标，评价卷柏总黄酮纯化工艺。对聚酰胺粒径、径高比、样品上样量以及洗脱液浓度进行了考察。除黄酮类的酚类化合物，聚合态花青素也能通过聚酰胺树脂柱得到一定程度的分离纯化，如李思佳等[20]将甘蔗梢浓缩液上聚酰胺层析柱柱，最终获得具有不同多酚含量的洗脱成分，并在此基础上进行多酚保鲜作用的探究。

2.4 大孔树脂技术分离纯化天然产物中多酚类化合物

大孔吸附树脂(Macroporous adsorption resin，MAR)是近代发展起来的一类有机高聚物吸附剂，70年代末开始将其应用于中草药成分的提取分离。 MAR的孔径与比表面积都比较大，其内部具有三维空间立体孔结构，具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点，因此在提取分离中应用较广泛。Bai等[21]对工业废弃苹果渣中的多酚类抗氧化成分进行探究，采用XAD-16提取分离残渣中的苹果多酚，获得了6个组分(API，APII，APIII，APIV， APV 和APVI)，经高效液相色谱分析得到这些组分中含量最多的是原花青素B2。在此基础上，采用DPPH和ABTS清除以及FRAP检测法测定各组分的抗氧化能力特性，证明APIII，即40%乙醇水溶液洗脱获得的组分，其抗氧化能力最强。冯颖等[22]采用HPD700 型大孔树脂分离纯化无梗五加果中的多酚类化合物。文中通过静态吸附解吸附容量进行树脂筛选，最终发现HPD700 型的吸附性能最佳；然后对其XAD-6的动态吸附解吸附参数进行了探讨，得到了具有最佳吸附和解吸附效果的分离纯化条件。

2.5 不同的柱色谱技术联用分离纯化天然产物中多酚类化合物

很多学者将不同类型的柱色谱技术同时采用，取长补短，在天然产物分离分析中应用更为广泛。吴慧等[23]对绿茶水提取物中主要次级代谢产物进行分离纯化，先后依次采用了大孔吸附树脂、硅胶柱色谱、凝胶柱色谱。最终从绿茶水提取物中分离纯化得到了7个多酚化合物。该文献结合化合物分子结构以及大小，在纯化过程中采用不同的制备技术，以达到高效的分离效果，为绿茶水提取物的化学成分的进一步研究提供了技术支持。作为夏季一种清凉爽口的水果，龙眼一直备受人们喜爱，但是由于它属于非呼吸跃变型果实，存在采后褐变现象，长期保存一直是人们头痛的问题。Shi等[24]针对这一问题进行了探究，采用聚酰胺柱色谱、凝胶柱色谱以及硅胶柱色谱对龙眼果实果皮组织中多酚氧化酶物质基础进行分离纯化，最终确定(-)-表儿茶素为其作用基质，从而找到了导致龙眼褐变变质的症结所在，为龙眼的储存保质提供了一定科学依据。

3 薄层色谱技术在分离纯化天然产物中多酚类化合物的研究进展

在分离制备技术的雏形阶段，薄层色谱(layer chromatography，LC)凭借其快速、简便、高分辨率的特点在天然产物分离分析领域占据一席之地，使用最多的便是硅胶吸附色谱，其次便是氧化铝吸附薄层色谱[14]。制备薄层色谱(Preparative layer chromatography，PLC)的尺寸和厚度均较常规分析检测型薄层色谱大，因此其负载量也比分析型薄层色谱高[25-26]。虽然制备薄层色谱比不上凝胶色谱、大孔树脂、高速逆流色谱等后起之秀，但是它在药用植物研究中的应用也不能忽略。例如程德军等[36]经过两次制备薄层色谱纯化技术分离得到杜叶草中的绿原酸。二次制备后，绿原酸的纯度能达到91.6%以上，相比其他制备技术，节省了时间，同时回避了该多酚化合物在碱性条件下的水解。Fu等人[27]将梅肉中采用制备薄层色谱分离纯化得到的无色花色苷和儿茶素作为模板分子对台湾食品"半干腌李子"中红棕色色素的形成机理进行探讨。通过模拟日光以及钨丝灯照射对半干腌李子的色素形成过程，从中发现了一些红棕色色素形成的规律。

4 液相色谱技术在分离纯化天然产物中多酚类化合物的研究进展

在前2节介绍的制备色谱技术中，常规柱色谱法虽然能够获得大量，高纯度的目标化合物，但是它耗时、耗溶剂，长期暴露在空气中，还可能会导致一些不稳定化合物的分解变质；而PLC技术基于无法实现工业化规模生产，已逐步被淘汰。基于这一系列的缺点，逐步发展建立了压力制备色谱，包括中低压制备色谱(柱压小于2 MPa)以及现在普遍的高压液相制备色谱技术(压力大于2 MPa)[14]。高压制备色谱，又称高效制备液相色谱(high performance preparative liquid chromatography， HPPLC)，采用HPPLC技术分离和纯化天然产物中多酚类化合物的研究报道众多，基于植物多酚以碳原子骨架的分类特点，本节对近几年来，HPPLC技术在植物多酚分离纯化中的应用进行了总结。

简单酚类在天然产物中一般作为代谢中间产物，能够通过HPPLC技术分离纯化得到。如Feng等[28]采用甲醇和水作为流动相，经过制备色谱纯化和重结晶操作后，获得了邻苯三酚和间苯二酚两个简单酚类化合物。经查证，这两个化合物是首次从该植物获得。Kanchanapoom和Kasai等[29]经过HPPLC的反复制备纯化，获得了3个毛蕊糖苷类衍生物，其中有1个为该植物中新化合物。该文章中采用水和甲醇为流动相，建立了16个梯度洗脱程序，对利用硅胶柱初步处理的多个组分进行精制。该研究分离纯化得到了多个新化合物，对于更深入的了解掌握西南猫尾树的化学组成具有重要意义。

4.1.2 HPPLC技术分离纯化C6-Cn型碳骨架多酚类化合物

利用HPPLC技术分离纯化天然产物中C6-Cn型碳骨架多酚类化合物的研究进展见表1 。

表1 HPPLC技术分离纯化天然产物中C6-Cn型碳骨架多酚类化合物

4.1.3 HPPLC技术分离纯化C6-Cn-C6型碳骨架多酚类化合物

利用HPPLC技术分离纯化天然产物中C6-Cn-C6型碳骨架多酚类化合物的研究进展见表2。

表2 HPPLC技术分离纯化天然产物中C6-Cn-C6型碳骨架多酚类化合物

5 高速逆流色谱(HSCCC)技术在分离纯化天然产物中多酚类化合物的研究进展

5.1 HSCCC技术分离纯化天然产物中多酚类化合物

高速逆流色谱技术(High-speed countercurrent chromatography，HSCCC)是由Ito等创建起来的一种连续高效的液-液分配色谱分离技术， 它不用任何固态的支撑物或载体[44]。它相对于传统的固-液柱色谱技术，具有较强的适用性、操作简便、高效快速、样品制备量大、费用低、适用于工业生产等优点。截止2009年，HSCCC已被用于从108中植物中分离纯化得到了363中化合物，其中关于分离纯化植物多酚类化合物的文献报道有36篇，所分离得到的多酚类化合物有57个，占总数的15.7%[45]。可见HSCCC技术在植物多酚的分离纯化领域应用广泛。表3综述了采用HSCCC技术分离纯化天然产物中植物多酚的应用进展。

表3 HSCCC技术分离纯化天然产物中多酚类化合物

5.2 HSCCC技术与其它色谱技术联用分离纯化天然产物中多酚类化合物

除单一的HSCCC分离纯化天然产物中植物多酚外，很多文献报道中，学者将其与其它分离技术联用，以达到更高效满意的效果。如Cao等[51]在分离纯化苹果渣中多酚类化学成分时，比较了凝胶柱色谱和HSCCC技术联用与溶剂萃取后直接采用HSCCC分离制备两种方法对产物纯度的影响，发现将以凝胶柱色谱辅助HSCCC技术能达到更好的分离纯化效果。该研究为进一步研究苹果渣中多酚化合物成分奠定了初步基础，同时也表明技术整合比单一的技术突破更具有应用价值。为了从洋蓟中获得高纯度的多酚类化合物，Shu等[52]将聚酰胺树脂柱与HSCCC离线联用，建立了二者相辅助的分离制备方法。经纯化制备后，最终得到绿原酸、木犀草素-7-O-β-D-芸香糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷和蓟多酚，其纯度分别为92.0%、98.2%、98.5%、98.0%。

6 展望

随着科技的不断进步，制备色谱技术日新月异。从兴起之初的纸色谱到目前广泛使用的HSCCC以及高压制备色谱，不论是制备的效率、制备的成本还是制备的选择性上都有巨大提高。

作为液-液分配色谱的典型代表，HSCCC技术在天然产物的分离分析领域具有分离效率高、制备量大、适于工业生产等优点的同时，仍受到一定因素的制约，如溶剂系统的选择没有完善的理论指导；而分离选择性只是凭借经验操作，机理尚不明确。但是HSCCC技术的研究并未停止，相信未来的HSCCC技术在这些理论体系上会更加完善，以实现实验室研究到工业化大生产的过渡。

制备型高效液相色谱(HPPLC)是在分析型高效液相色谱(HPLC)的基础上发展的，其理论基础比HSCCC成熟很多，发展的更为完善。与HPLC一样，其核心部件为色谱柱，也成为HPPLC技术进一步完善发展的制约条件，比如在其色谱填料上，不仅市场价格高，而且其填充技术也存在缺陷，如何获得优质价廉的高性能填料，并发展均匀密实的填充技术是提高HPPLC技术的分离灵敏度的关键所在。HPPLC技术的定性能力差，将制备纯化型与分析型的色谱联合为整体，实现一体化操作控制的愿景仍有待更深入的研究。