进展期胃癌患者miRNA-375表达对患者临床病理特征、铂类化疗药物选择及临床预后的影响

孙 晗， 费素娟

1.徐州医科大学临床学院，江苏 徐州 221004；2.徐州市中心医院消化内科；3.徐州医科大学附属医院消化内科

在消化道肿瘤疾病中，胃癌是发病率及死亡率最高的肿瘤之一，随着社会的不断发展，胃癌的发病也呈现出年轻化的趋势[1]。目前研究发现，在早期胃癌患者中，其临床表现和相关体征均不典型，导致胃癌早期检出率较低，在确诊时多处于中晚期，往往治疗效果不佳，且预后较差[2-3]。根据患者的病情不同，手术仍是治疗胃癌的主要方式，术后的放化疗是控制胃癌复发、病情进展及改善预后的有效手段，铂类药物是胃癌化疗常用的药物之一，但因个体差异问题，其治疗效果也有差异[4-5]。多项研究显示，在胃癌患者中miRNA-375与患者临床特征及预后相关[6-7]。基于此，本次研究检测进展期胃癌患者miRNA-375的表达水平，并分析miRNA-375表达对临床病理特征、铂类化疗药物选择、临床生存预后的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2013年1月1日至2013年12月31日在徐州市中心医院接受手术治疗的进展期胃癌患者86例作为研究对象，收集患者的胃癌组织及癌旁组织。纳入标准：(1)所有患者的诊断均经过病理组织确诊；(2)诊断为进展期胃癌；(3)在入组前未接受放疗及化疗；(4)患者年龄>18岁；(5)预计生存期>1个月；(6)均接受胃癌根治术。排除标准：(1)合并其他部位肿瘤者；(2)严重肝肾功能不全者；(3)临床资料不完整者；(4)早期胃癌患者；(5)不同意参加本次研究者；(6)失访者。所有入组患者均签署知情同意书，本研究已呈报我院伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 标本收集：癌组织标本取自进展期胃癌组织中心区，经病理证实为胃癌；癌旁组织标本取自距离癌组织边界直线>5 cm，并经病理证实为胃正常组织。标本均置于-80 ℃液氮中保存。

1.2.2 miRNA-375的检测：采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(qRT-PCR)检测，取出置于液氮中的标本解冻，取1 g标本在研磨器内充分研磨， 加入1 ml的Trizol RNAiso(购自美国Invitrogen 公司)，提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书进行反转录操作，提取20 μg的RNA将其反转录为cDNA，内参基因GAPDH、miRNA-375的引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其中GAPDH的上游引物为5′-GGACCTTCAGCTACAACGGGTGCG-3′；下游引物为5′-ATGAAGCAAGGCAGTATGTCTTC-3′；长度为95 bp；miRNA-375的上游引物为5′-CTGAGTCCAGGTTGCCAAATG-3′；下游引物为5′-TATGGGCATCATCGCCCGGATCA-3′；长度为105 bp。qRT-PCR的反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环,在反应完成后在72 ℃的条件下继续进行延伸10 min。选择FS2000系统对结果进行分析，根据公式2-△△CT法计算出mRNA的相对表达量。

1.3 观察指标比较进展期胃癌患者癌组织及癌旁组织miRNA-375表达水平。对miRNA-375与进展期胃癌患者临床病理特征关系进行分析。取进展期胃癌患者miRNA-375表达的平均水平作为分界值，分为低水平组和高水平组，并对预后进行比较。分析进展期胃癌患者miRNA-375表达与铂类药物化疗对预后的影响关系。对影响进展期胃癌患者预后的因素进行单因素及多因素Cox回归模型分析。

2 结果

2.1 纳入样本的临床资料本研究共纳入进展期胃癌患者86例，收集有效癌组织标本86例，癌旁组织标本86例，男61例，女25例，年龄37～73岁，中位年龄58岁。

2.2 进展期胃癌患者不同组织miRNA-375相对表达水平qRT-PCR结果显示，癌组织中miRNA-375相对表达水平为0.035±0.005，而癌旁组织中miRNA-375相对表达水平为0.183±0.023，两组比较，差异有统计学意义(t=12.386，P=0.000)(见图1)。

2.3 miRNA-375相对表达水平与进展期胃癌临床病理特征相关性对miRNA-375相对表达水平与进展期胃癌临床病理特征相关性进行分析，结果显示，进展期胃癌患者分化程度、TNM分期、淋巴结转移与miRNA-375相对表达水平有关，差异有统计学意义(P<0.05)，其中分化程度越低、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移患者miRNA-375相对表达水平越低；而性别、年龄、肿瘤直径与miRNA-375相对表达水平无相关，差异无统计学意义(P>0.05)(见图1、表1)。

图1 进展期胃癌患者癌组织与癌旁组织中miRNA-375相对表达水平

表1 miRNA-375相对表达水平与进展期胃癌患者临床病理特征关系Tab 1 Relationship between miRNA-375 relative expression level and clinicopathological features of advanced gastric

2.4 miRNA-375相对表达水平与进展期胃癌患者预后生存曲线以miRNA-375均值作为临界值，对进展期胃癌患者不同miRNA-375表达水平的预后进行对比，miRNA-375高表达患者1年、3年及5年生存率分别为95.55%、82.22%、37.77%，miRNA-375低表达患者1年、3年及5年生存率分别为87.80%、48.78%、17.07%。miRNA-375高表达患者5年、3年、1年生存率明显高于miRNA-375低表达患者，差异有统计学意义(Z=4.389，P=0.018)(见图2)。

图2 miRNA-375相对表达水平与进展期胃癌患者预后生存曲线

2.5 进展期胃癌患者miRNA-375表达与铂类药物选择预后生存期对进展期胃癌患者是否接受铂类药物化疗预后生存期进行对比，结果显示，差异无统计学意义(Z=1.873，P=0.137)(见图3)。在接受铂类药物化疗的进展期胃癌患者中，miRNA-375低表达生存预后好于miRNA-375高表达患者，差异有统计学意义(Z=4.805，P=0.010)(见图4)。在未接受铂类药物化疗的进展期胃癌患者中，miRNA-375高表达预后要好于miRNA-375低表达患者，差异有统计学意义(Z=3.967，P=0.035)(见图5)。

图3 进展期胃癌患者是否接受含铂类药物化疗预后生存曲线Fig 3 Survival curve of patients with advanced gastric cancer receiving platinum-based chemotherapy or not

图4 接受铂类药物化疗的进展期胃癌患者不同miRNA-375

表达的生存曲线

Fig 4 Survival curve of different miRNA-375 expression in patients with advanced gastric cancer receiving platinum-basedchemotherapy

图5 未接受铂类药物化疗的进展期胃癌患者不同miRAN-375表达的生存曲线

2.6 影响进展期胃癌患者预后的单因素分析对影响进展期胃癌患者预后的因素进行单因素分析，结果显示，年龄、分化程度、TNM分期、淋巴结转移、miRNA-375表达水平与进展期胃癌患者预后相关，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中年龄≥60岁、分化程度越低、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、miRNA-375高表达的进展期胃癌患者预后较差；而性别、肿瘤直径与进展期胃癌患者预后无关(P>0.05)(见表2)。

2.7 影响进展期胃癌患者预后的Cox回归模型多因素分析对进展期胃癌患者的预后生存期进行Cox回归模型多因素分析，结果显示，年龄(<60岁、≥60岁)、分化程度(低分化、中分化、高分化)、TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期)、miRNA-375表达(高表达、低表达)是影响进展期胃癌患者预后的独立因素(P<0.05)；而淋巴结转移不是影响进展期胃癌患者预后的独立因素(P>0.05)(见表3)。

表2 影响进展期胃癌患者预后的单因素分析

表3 影响进展期胃癌患者预后的Cox回归模型多因素分析Tab 3 Multivariate analysis of Cox regression model influencing prognosis of advanced gastric cancer patients

3 讨论

我国是胃癌发病大国，给人们身体健康及生命安全带来了极大的威胁[8]。目前关于胃癌的发病机制尚未完全明确，随着医学科学技术的不断发展及医学学者的不断探索，越来越多的研究认为胃癌的发生、发展与多种基因、多个因素有关，有研究显示，miRNA不仅参与了机体的生长发育，也参加了肿瘤的发生、发展[9-10]。

miRNA-375定位于人类染色体2q35区，最早的研究提示miRNA-375与胰腺功能有关[11]，可以调节胰岛细胞发育及胰岛素分泌，后来有研究发现，在肝癌、胰腺癌、大肠癌、食管癌等中miRNA-375表达下降，推测其可能与肿瘤的发生、发展有关[12]。上述研究显示，对于进展期胃癌患者，癌组织内miRNA-375的表达水平低于正常组织。分析原因可能为miRNA-375参与负向调节抑癌基因的表达，或miRNA-375可能具有抑制癌症发展的功能，与多项研究结果相似[13-15]。

在对miRNA-375表达与进展期胃癌患者临床病理特征的研究中发现，患者癌症分化程度、TNM分期、淋巴结转移与miRNA-375水平有关。其中分化程度是反映肿瘤良恶性的主要指标，而miRNA-375表达水平低，其分化程度越低，说明肿瘤恶性程度越高。TNM分期是判断肿瘤进展程度的主要指标，不同分期与治疗方案的选择及治疗效果直接相关，而miRNA-375表达水平低，TNM分期越高，说明miRNA-375可能与胃癌的进展有关。淋巴结转移是肿瘤治疗和预后判断的有效参考，miRNA-375低表达时存在淋巴结转移。Shafiee等[16]研究提示，miRNA-375过表达可以调节肿瘤细胞的增殖和侵袭，支持本结果。对生存预后对比发现，miRNA-375高表达患者的预后生存期明显好于miRNA-375低表达患者，其原因可能为miRNA-375降低抑癌基因或通过其他信号通路抑制肿瘤的进展，当miRNA-375低表达时，患者生存预后较差。与马晓颖等[17]研究结果相似。

我们对进展期胃癌患者是否接受铂类药物化疗进行了亚组分析，结果显示，接受铂类药物化疗患者中，miRNA-375低表达生存预后好于miRNA-375高表达，而未接受铂类药物化疗的进展期胃癌患者中，miRNA-375高表达预后要好于miRNA-375低表达。因此我们推测分析在进展期胃癌患者中，铂类药物化疗效果可能与miRNA-375的表达水平有关，进展期胃癌miRNA-375低表达患者接受铂类药物化疗能获得更好的预后，为进展期胃癌的治疗药物选择提供了新的参考依据。而出现本次结果，其原因可能为miRNA-375通过介导其他信号通路来调控铂类药物化疗，也可能由本次样本的选择性偏倚导致。Takashi等[18]提示，胃癌铂类药物化疗效果可能与miRNA-375表达相关，支持本次研究。Zhou等[19]研究则提示，在胃癌患者中，当miRNA-375高表达时可以提高铂类化疗药物敏感性，与本研究结果有差异，因此，miRNA-375对铂类药物效果的影响还需要进一步研究探索。

对影响进展期胃癌患者预后的因素进行分析，结果显示，年龄、分化程度、TNM分期、miRNA-375表达是影响进展期胃癌患者预后的独立因素。年龄是正常人生存时间的主要参考之一，年龄越大，死亡风险越大，而癌症患者也不例外。分化程度低说明癌症的恶性度高，患者的预后也就越差。TNM分期越高说明患者的疾病发展越靠近晚期，对于肿瘤的治疗有直接影响，因此预后会差。miRNA-375表达水平是本次研究的主要指标，结果显示，miRNA-375是影响进展期胃癌预后的独立因素，其原因可能为miRNA-375通过多种机制来调控进展期胃癌的发生、发展。Thapa等[20]研究则显示，AQP mRNA、年龄、分化程度、TNM分期是影响胃癌患者预后的独立因素。míd等[21]研究也提示，miRNA-375对胃癌患者预后生存期有预测价值。

综上所述，对于进展期胃癌患者，癌组织内miRNA-375表达低于癌旁组织，且miRNA-375表达水平与临床病理特征及预后有关，对进展期胃癌患者化疗药物的选择，可以参考miRNA-375表达水平判断是否选择铂类药物化疗，年龄、分化程度、TNM分期、miRNA-375表达水平是影响进展期胃癌患者预后的独立因素。