提高愈创木酚染色法检测稻谷新陈度准确性的研究

王天娇，庞文渌*

（沈阳师范大学粮食学院，沈阳 110034）

稻谷收购过程中，如能快速、准确地判断出稻谷的新陈度，对于有效控制稻谷收购中“以次充好、以陈充新”的违法行为、减少售买双方因新陈度认定而产生的纠纷无疑会起到重要的作用。在稻谷新陈度检测实践中发现，采用GB 5492-2008附A中愈创木酚染色法检测稻谷新陈度，具有原理简单、操作方便、检测快速等突出优点，但也存在重现性差、结果不准等缺陷。一是检测结果随样品状态变化而变化，如同一份样品使用糙米与大米的检测结果就不同；二是检测结果随检测试验操作条件变化而变化，如检测时的温度不同、试剂的用量不同、反应的时间不同则检测结果也不同。这些问题的存在不仅影响了该法的推广使用，也容易因前后检验结果不一致而引起纠纷。

因此，有必要通过实验筛选出最佳检测条件，进而提高愈创木酚染色法检测稻谷新陈度的准确性。

1 实验原理与设计

1.1 实验原理

新鲜稻谷米粒皮层中所含的过氧化物酶 （一种以血红素为辅基的酶），是一种能够催化过氧化物分解的酶。在过氧化物酶的作用下H2O2分解释放出O2，使愈创木酚被氧化生成红色的四愈创琨，进而使被愈创木酚溶液浸过的米粒也被染成红色。由于新稻谷所含的过氧化物酶活性强故被染成红色 （稻谷越新鲜，过氧化物酶活性就越高，染色就越深），而陈稻谷由于该酶已失活故不变色，因此可依据样品中变色米粒占供试样品粒的百分率判断稻谷新陈度。

1.2 实验设计

针对检测结果随检测实验操作条件 （如试剂的浓度不同、检测时的温度不同、反应的时间不同）不同而出现波动的问题，拟采用对照实验筛选出最佳检测条件组合。按照三因子（双氧水浓度、染色温度、染色时间）、三水平 （双氧水浓度分别为1%、2%、3%，染色温度分别为20℃、30℃、40℃，染色时间分别为 1 min、2 min、3 min）设计正交实验，正交实验因素水平如表1所示，共匹配出的9种实验条件组合，按照GB 5492-2008附表A中愈创木酚反应法进行实验操作，进而得出每一实验条件组合下的变色粒数，据此计算其新陈度。基于上述的实验原理（陈粮粒无论反应条件如何都不会变色，所以能变色的肯定是新粮粒），在9组实验结果中，新稻谷染色率最高的（新陈度最高的）那组应该更接近实际的新陈度检验条件，故该组实验条件组合即为最佳检测条件。

表1 正交实验因素、水平表

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 仪器用具

吉林鼎力粮食机械有限公司产JLGJ-45型电动砻谷机，郑州检验碾米机厂产JNMJ-3型碾米机，上海力辰帮西仪器科技有限公司产HH-6型数显恒温水浴锅，100 mL容量瓶，100 mL量筒，5 mL移液管，18 mm×180 mm具塞试管，培养皿等。

2.1.2 试剂试液

1%愈创木酚溶液：移取1 mL愈创木酚原液到100 mL容量瓶中，先加入60 mL无水乙醇使之溶解，再加入蒸馏水稀释定容至100 mL。愈创木酚溶液现用现配，以防氧化失效。

1%过氧化氢溶液：移取1 mL的30%过氧化氢原液置于100 mL容量瓶中，加入29 mL蒸馏水混合均匀至30 mL。

2%过氧化氢溶液：移取2 mL的30%过氧化氢原液置于100 mL容量瓶中，加入28 mL蒸馏水混合均匀至30 mL。

3%过氧化氢溶液：移取3 mL的30%过氧化氢原液置于100 mL容量瓶中，加入27 mL蒸馏水混合均匀至30 mL。

2.1.3 实验样品

辽宁沈阳地区2019年产东北晚粳稻谷（即当年秋季新收获的稻谷）。

2.2 实验方法

2.2.1 样品处理

将样品稻谷先用砻谷机脱掉外壳，然后用碾米机碾磨至相当于四级大米精度（背沟有皮，米粒表面皮层残留面积不超过1/3的米粒占75%以上），使其暴露出新鲜的皮层及胚部。

2.2.2 染色反应

以样品处理获得的大米为实验材料，自制27份实验样品，每份随机数取大米50粒。分为9个实验组，为了提高实验结果的可信度，每组使用三份样品做平行实验，分别在正交实验设计的9组实验条件下进行染色反应。操作顺序为：将每组试样分别装入18 mm×180 mm具塞玻璃试管并加入1%愈创木酚溶液浸过大米，摇动震荡30次后弃去液体，再加入3滴不同浓度的（1%、2%、3%）过氧化氢溶液并放在不同温度（20℃、30℃、40℃）的水浴中反应不同的时间（1 min、2 min、3 min），然后将试样转移到培养皿中弃去液体，挑选并统计粒面呈红色的米粒计算染色率。

3 实验结果与分析

3.1 实验结果

以过氧化氢浓度（%）、反应时间（min）、反应温度（℃）为影响因素，采取正交实验的方法分别测得不同实验条件组合下的米粒染色结果如表2所示。

3.2 结果分析

从表2中数据可见，当加入过氧化氢的浓度不同、反应温度不同、反应时间不同时，检测结果也不尽相同；过氧化氢浓度越高、反应温度越高、反应时间越长，染色率越高；从影响因素的主次看，过氧化氢浓度＞反应温度＞反应时间；最佳检测条件组合为过氧化氢浓度3%、反应温度40℃、染色时间3 min（因该条件下染色率最高为92%）。

表2 正交实验结果表

4 实验结论与建议

4.1 实验结论

愈创木酚染色法检测稻谷新陈度具有快速、简便的优点，但实验结果受实验条件影响较大，不宜准确判定；愈创木酚染色法检测稻谷新陈度，即使是未掺一粒陈稻的新稻谷也不会全部被染色，最高染色率也只在九成上下。

4.2 实验建议

4.2.1 规范检测条件，减小检测误差

前述实验条件不同检测结果不同。因此，为了减小检测误差、避免出现纠纷，建议规范愈创木酚染色法检测稻谷新陈度的实验条件，如过氧化氢的浓度、反应温度、反应时间等。尽管在过氧化氢浓度为3%、反应温度为40℃、反应时间为3 min时染色率最高，但考虑到新陈度检测需要方便、快捷，建议用浓度3%的过氧化氢做试剂，反应在20℃以上的室内进行，反应时间1 min以上（不急可等到3 min）。另外，如果为了提高检测结果的可信度做双实验时，在两次结果相差不大的情况下，应以染色率最高的为检测结果。其理由是：基于前面所述的检测原理，能够被染色的肯定是新稻谷，但由于受反应条件的限制并不是所有的新稻谷都能被染色，因而以染色率最高的代表被测样品的新陈度应该更符合被测稻谷真实情况。

4.2.2 染色率接近九成，可判定为未掺陈的新稻谷

为了避免因样品不真对实验造成的影响，本实验所用稻谷均采自当年收获的新稻谷。从实验结果可以看出，即使是未混入一粒陈稻的新稻谷也不会100%被染色。究其原因，①样品中有些稻粒可能受自身因素或病虫害影响已经丧失生理活性，其皮层中的过氧化酶已经失活，所以即使是新稻粒也不会被染色；②样品中有些生理活性稍差的稻粒，在过氧化氢浓度及反应温度不够高、反应时间不够长的情况下，也可能不会染色或染色不明显。据此，在使用此法检测稻谷新陈度时，即使样品未完全变色也不能认定掺入陈稻，只要染色率接近90%（在4.1建议的实验条件下）基本上可认定为无掺陈的当年收获新稻谷。