海藻酸钠复合工程化软骨细胞对兔佐剂性关节炎关节滑膜转录因子RORγt mRNA、 Foxp3 mRNA表达的影响

易伟 张旭东，2 蒋雯雯 韦登明

(1宁波大学医学院病理学系，浙江 宁波 315211;2湖北医药学院实验动物中心)

类风湿关节炎(RA)是一种常见病和多发病，但其发病机制仍然不是十分清楚。近年来研究表明RA的发生与辅助性T细胞17型/调节性T细胞(Th17/Treg)的失衡有关〔1，2〕。维甲酸相关核孤受体(ROR)γt mRNA通过调控Th17细胞，增加其分泌白细胞介素(IL)-17、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α等多种细胞因子的水平而加重炎症反应。Treg细胞是一类CD4+T细胞亚群，受转录因子叉头蛋白(Fox)p3 mRNA调控，Treg可通过分泌抑炎因子(IL-10、TGF-β、IL-35等)来抑制免疫应答和炎性反应〔3〕。前期研究表明海藻酸钠复合工程化软骨细胞可修复兔佐剂性关节炎软骨缺损，并且有明显的抗炎作用，但其抗炎作用不是十分清楚〔4〕。而海藻酸钠复合工程化软骨细胞对于RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的影响未见报道。本文旨在探讨海藻酸钠复合工程化软骨细胞调节RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平抗兔佐剂性关节炎的机制。

1 实验材料

1.1实验动物 从浙江省余姚泗门镇建飞实验兔养殖场〔许可格证号：SCXK(浙)2012-0050〕购入40只新西兰兔(清洁级，二月龄，体重2～3 kg，雄性)。适应性饲养1 w后，随机分为对照组(A组)，模型组(B组)，细胞治疗组(C组)，支架治疗组(D组)，支架复合细胞组(E组)各8只。

1.2实验试剂 转化生长因子(TGF)-β酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海桥杜生物科技有限公司)；兔抗TGF-β1多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；TGF-β1、胰岛素样生长因子(IGF)-1(美国peprotech公司)；阿利新蓝(上海生工生物工程有限公司)；EasyPure®RNA Kit、2×TransTaq®High Fidelity(HiFi) PCR SuperMix、EasyScript®First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技术有限公司)；完全弗佐剂(FCA)、海藻酸钠粉剂(美国sigma公司)；UltraPower®DNA染料、6×上样缓冲液(北京百泰克生物技术有限公司)。

1.3实验仪器 台式超高速低温离心机(Centrifuge 5810R，德国Eppendorf 公司)、二氧化碳细胞培养箱(美国ThermoFisher Scientific公司)、包埋机(BM-Ⅶ，宏业医用仪器公司)、石蜡切片机(HM-325，德国LEICA公司)、PCR仪(3522，购于德国Eppendorf 公司)、全波长酶标仪(美国ThermoFisher Scientific公司)、电泳仪(DYY-11B，北京六一仪器厂)、凝胶成像系统(Molecular Image Gel Doc，购于美国Bio-Rad公司)。

1.4实验方法

1.4.1兔佐剂性关节炎(AA)模型制备 20%乌拉坦静脉按5 mg/kg的剂量注入麻醉动物，麻醉起效后，将0.5 ml FCA注入动物膝关节，14 d后再次注入FCA。3 w后察看兔子膝关节，若红肿增粗则造模成功。

1.4.2种子细胞的诱导分化 从兔骨髓中穿刺抽取间充质干细胞诱导分化为软骨细胞，其过程包含分离纯化、培养与诱导分化、鉴定等操作〔4〕，其主要步骤：兔骨髓液抽取：用10%乌拉坦麻醉动物后，抽取膝关节骨髓液5 ml左右。自体骨髓间充质干细胞的分离：用等量percoll淋巴细胞分离液与抽取的骨髓液混合，以2 000 r/min离心15 min，吸取8 ml培养液加入并充分混匀，1 200 r/min，离心5 min，弃上清液，重复一次，将percoll分离液洗去，移入培养瓶置于二氧化碳培养箱(37℃，5%CO2)中培养。软骨细胞的诱导：培养48 h后，骨髓间充质干细胞呈梭形涡旋状分布，细胞生长至80%～90%时，胰蛋白酶消化贴壁细胞并传代培养。至P3代自体骨髓间充质干细胞生长至培养瓶80%左右时，在常规培养液中加入约10%的诱导剂换液培养细胞，约2 w后自体骨髓间充质干细胞绝大部分可诱导成软骨细胞。软骨细胞的鉴定：软骨细胞多呈现星形、多角形。阿利新蓝染色时细胞呈蓝色即阳性。

1.4.3种子细胞与支架的混合 于24孔培养板中每孔加入400 μl的6%的海藻酸钠凝胶与培养基的混合物，再加入1%CaCl2溶液20 μl，于15 min后吸取全部的CaCl2后加入细胞培养液。将支架与种子细胞悬液放入20 ml注射器内，抽注射器让细胞悬液与支架材料混匀后培养。

1.4.4支架复合物的治疗 实验动物耳缘静脉麻醉后，A组、B组于关节腔内注入0.5 ml生理盐水；C组注入等量海藻酸钠支架；D组注入等量软骨细胞；E组注入等量支架复合软骨细胞。

1.4.5兔膝关节滑膜苏木素-伊红(HE)染色 治疗30 d后处死动物，取兔子膝关节，甲醛溶液固定后脱钙，取材，经过水洗、脱水透明、切片脱蜡、HE染色等操作，光学显微镜下观察。

1.4.6ELISA检测外周血细胞因子TGF-β1、IL-10、IL-22表达 用兔外周血3 ml离心后取上层液，按照试剂盒说明书用ELISA检测外周血细胞因子TGF-β1、IL-10、IL-22表达。

1.5RT-PCR检测Foxp3 mRNA和RORγt mRNA 的表达 使用Trizol法提取总RNA。用2 μl ddH2O调零，吸取2 μl RNA，测定RNA溶液260/280的比值和浓度。逆转录合成cDNA按说明书操作。RT-PCR使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司设计，合成，纯化。RORγt mRNA引物：上游：5′-TCTGGAAGCTGTGGGATAGA-3′；下游：5′-GAGGAGCCTGTGGAGAAATAC-3′。Foxp3 mRNA引物：上游：5′-GGCCCTTCTCCAGGACAGA-3′；下游：5′-GCTGATCATGGCTGGGTTGT-3′。GAPDH：上游：5′-CCTCATGCCATCCTGCGTCT-3′；下游：5′-GCCACAAGGATTCCATACCCA-3′。PCR体系如下：cDNA 5 μl；上游引物(10 μmol/L)1 μl；下游引物(10 μmol/L)1 μl；2×TransTaq®HiFi PCR SuperMix25 μl；ddH2O 18 μl；总计50 μl。PCR条件：94℃ 30 s预变性；94℃ 5 s，60℃ 30 s，35个循环。最后进行琼脂糖凝胶电泳。

1.6统计学分析 采用SPSS22.0软件进行方差分析，Dunnett-t检验。

2 结 果

2.1AA模型制备结果 B组关节外观红肿，其内可见增生现象和积液，并见乳白色软骨。A组关节无红肿，可见透明软骨，未见增生现象。

2.2细胞的培养鉴定 间充质干细胞培养P3代成功后，加入诱导液使其分化成软骨细胞，用阿利新蓝染色，蓝色显示诱导成功。

2.3关节滑膜的HE染色结果 A组关节滑膜无异常，无炎细胞，B组炎细胞较多，C组、D组、E组较B组炎症情况均有所改善。

2.4各组兔外周血中TGF-β1、IL-10、IL-22的ELISA检测结果 与B组相比，A、E组兔外周血TGF-β1水平明显多(P=0.002，P<0.007)，C组及D组TGF-β1差异无统计学意义(P>0.05)。各组外周血IL-10、IL-22水平与B组比较无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.5RT-PCR检测各组兔滑膜中Foxp3 mRNA与RORγt mRNA的表达量水平比较 与B组相比，A组兔关节滑膜中Foxp3 mRNA的表达水平高(P<0.05)，RORγt mRNA表达水平明显低(P<0.01)，C组和D组Foxp3 mRNA表达水平无差异(P>0.05)，E组Foxp3 mRNA表达水平高于B组(P<0.05)，C、D、E组RORγt mRNA表达水平明显低于B组(P<0.05，P<0.01)。见表2、图1。

表2 各组免滑膜中Foxp3、RORγt mRNA表达比较

图1 兔关节滑膜中Foxp3、RORγt mRNA电泳条带

3 讨 论

骨髓间充质干细胞可通过改变生长环境诱导形成软骨细胞，再与海藻酸钠支架复合成组织工程化细胞，对佐剂性关节炎有明显的抗炎疗效〔4，5〕。海藻酸钠支架不仅可以给软骨细胞的增殖分化提供适宜的场所，而且与滑膜有较好的生物相容性，其降解产物无毒，是目前作为支架材料的完美选择〔5～7〕。

目前一致认为RA和病人关节中的淋巴细胞及其分泌的多种炎症因子联系密切〔8〕。最近研究表明Th17/Treg和RA的发生密切相关，上述2种细胞对RA患者关节软骨的破坏产生重大影响，已有研究表明〔9，10〕，Th17/Treg介导RA的免疫反应。初始T细胞可分化为Th17或Treg，Th17受RORγt mRNA调控，而低浓度的 TGF-β1和 IL-6 可共同诱导 RORγt 的表达。Th17可产生IL-17、IL-6、IL-22等，其中IL-17是主要的促炎效应因子，关节破坏与IL-17有关，并且IL-17还可通过活化滑膜细胞及上调造血因子的表达致使滑膜增生，加重RA的发生发展〔11，12〕。Treg可增加机体的自身耐受且保持对炎症因子的免疫无反应性〔13〕。本研究结果提示海藻酸钠支架或工程化软骨细胞均有一定的抗炎作用。支架复合软骨细胞可提高关节滑膜Foxp3 mRNA表达水平降低RORγt mRNA表达水平从而起到抗炎作用。

TGF-β1是影响初始T细胞向Th17/Treg的分化的主要因素。TGF-β1低表达可与IL-6共表达增加Th17的分化，TGF-β1高浓度增加Treg的分化〔14〕。本研究结果提示TGF-β1可能通过影响RORγt mRNA、Foxp3 mRNA进而影响初始T细胞的分化方向来影响各组RA的发生发展。

IL-10是T细胞和APC的抑制因子，能够改善RA滑膜炎症情况，下调破骨细胞的激活，也可减轻关节肿胀程度，改善软骨损坏情况。但也有研究表明IL-10可增加成熟B细胞数量并阻止B细胞凋亡从而达到致炎作用。目前有研究表明〔15～17〕关于RA患者血清中IL-10的检测结果不一致，表达量有升高也有降低的。本研究结果显示，与B组相比，各组血清中IL-10的表达量无变化。造成此现象的原因可能有实验动物是兔，与RA患者存在表达上的区别，其次IL-10主要表面在滑膜细胞膜上或存在于滑液中，而关节的营养供应不足，较小范围的炎症反应未能触发机体的免疫调节功能，本实验检测的是血清中的IL-10。关于RA患者中外周血IL-10与RA的关系需要更多实验加以验证研究。

IL-22由Th1、Th17、Th22等细胞产生，在RA进程中起重要作用。IL-22与骨破坏X线分期呈正向关联(P<0.05)，是骨破坏的危险因素，可用于评价RA的病情〔18〕。对RA患者外周血IL-22检测结果显示，RA组IL-22浓度高于对照组(P<0.05)〔19〕；RA患者滑膜组织检测结果显示，与健康人相比，IL-22 mRNA的表达水平增加，IL-22受体的转录水平也随之增加〔20〕。本研究结果与以往研究不同的原因可能是机体是一个协调统一的整体，一个免疫反应发生，其对应的免疫调节也应激产生，使机体维持在一定的平衡之中。滑膜炎症的产生使机体中抑炎因子也会相应分泌，而局部炎症未能引发全身免疫调节反应，因此血清中IL-22可能无明显变化。