长链非编码RNA AC007271.3与TSGF、SCCA等联合检测对口腔鳞癌的诊断价值

邵婷如 陈细婷 郑则楠 黄光钊 吕晓智

(南方医科大学南方医院口腔颌面外科，广东 广州 510515)

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是最常见的口腔恶性肿瘤[1-2]，不仅严重破坏患者口腔颌面部的外形，影响美观及吞咽、咀嚼和语言等功能，还危及患者生命安全[2-3]。尽管OSCC发病位置相对表浅，但临床上大多数患者就诊时已是晚期。虽然目前放疗、化疗、手术治疗、靶向治疗和免疫治疗等已经取得了一定的进展，但晚期OSCC的治疗效果并不满意，晚期OSCC患者的5年生存率为40%～50%[4-5]。因此，OSCC的早期和精准诊断对于提高OSCC患者的预后至关重要。

前期通过对OSCC及癌旁配对正常口腔黏膜组织标本基因芯片进行检测发现，长链非编码RNA(lncRNA)AC007271.3在OSCC中异常高表达[6]，并可通过Wnt/β-catenin信号通路促进OSCC的生长、侵袭以及迁移[7]。进一步研究发现，lncRNA AC007271.3由OSCC肿瘤细胞分泌，在OSCC患者的血清中呈稳定表达，并且手术后患者血清中的AC007271.3显著降低，提示AC007271.3可能是一种有效的OSCC肿瘤诊断标志物[6-7]。而鳞状细胞癌抗原(SCCA)、癌胚抗原(CEA)以及肿瘤特异性生长因子(TSGF)是目前临床常用的肿瘤诊断标志物[8-10]。本课题组前期的研究曾发现AC007271.3、SCCA及TSGF在OSCC患者血清中异常表达，对OSCC具有一定的临床诊断价值[6]，但是研究的样本量相对较少，因此本研究进一步扩大样本量，通过比较OSCC患者以及健康者血清中AC007271.3、SCCA、TSGF和CEA的表达情况，探讨上述肿瘤标志物对OSCC患者早期诊断及预后评估的价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择我院2014年9月—2019年9月收治并诊断为OSCC的患者共160例作为研究组(所有患者入组前均未接受过放化疗或其他抗肿瘤治疗，并经我院病理检查确诊为OSCC且均为原发病灶)，其中Ⅰ～Ⅱ期OSCC患者97例，Ⅲ～Ⅳ期OSCC患者63例；另选择同期于我院体检健康者160例作为对照组。本项研究经我院伦理委员会批准(伦理号：AF/SC-09/03.2)。

1.2 研究方法

1.2.1一般资料的收集 收集OSCC患者的一般资料，包括年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤TNM分期、肿瘤病理分化程度、淋巴结转移情况等。

采用实时定量PCR法检测所有研究对象血清中AC007271.3的表达水平。使用TRIzol LS试剂(Ambion公司，Waltham，MA，美国)自患者血清中提取总RNA，逆转录试剂盒(RR047A,Takara公司,日本)以及荧光定量试剂盒(RR820A,Takara公司,日本)进行逆转录和PCR扩增。采用StepOne Plus实时定量PCR仪进行两步法扩增反应，数据经导出后，采用2-△△CT法进行分析。具体引物序列见表1。

表1 引物名称和序列

1.3 血清中各指标诊断价值的评估

通过ROC曲线下面积(AUC)、诊断特异度及诊断灵敏度分别评估AC007271.3、SCCA、TSGF、CEA单独检测以及各标志物间联合检测对OSCC的诊断价值。采用Cox比例风险模型及Kaplan-Meier生存曲线评估AC007271.3高表达和低表达与OSCC患者预后的关系。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0(IBM, Armonk, NY, USA)及GraphPad Prism 5.0(La Jolla, CA, USA)进行数据分析。同组样本间比较采用配对t检验或方差分析，组间比较采用非参数Mann-WhineyU检验或Welch检验。联合检测采用二元Logistic回归分析，通过ROC曲线评估各指标的诊断价值。采用Cox比例风险模型及Kaplan-Meier生存曲线分析OSCC患者预后情况。所有检测均为双尾，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清中AC007271.3、SCCA、TSGF、CEA水平与OSCC患者临床病理特征的关系

实时定量PCR方法检测结果显示，研究组和对照组患者的血清中AC007271.3表达水平分别为914.3±313.2、1.840±0.3419，研究组显著高于对照组(t=2.598,P<0.05)。并且Ⅲ～Ⅳ期和Ⅰ～Ⅱ期OSCC患者血清中AC007271.3的表达水平呈明显差异(t=2.547,P<0.05)。肿瘤不同TNM分期、不同分化程度、有无区域淋巴结转移的OSCC患者血清中AC007271.3、TSGF及SCCA的表达差异具有显著性(t=2.239～4.209,P<0.05)。另外，AC007271.3表达同时与患者是否吸烟有关(t=2.598,P<0.05)。而血清中CEA表达与OSCC患者临床病理特征无明显关系(P>0.05)。见表2。

表2 血清中不同检测指标与OSCC患者临床病理特征的关系

2.2 血清肿瘤标志物联合检测对OSCC诊断价值

AUC显示，AC007271.3对OSCC的诊断价值最高(AUC为0.877)，诊断灵敏度为80.0%，诊断特异度为83.1%，其次为SCCA(AUC为0.792)，诊断灵敏度为66.9%，诊断特异度为87.5%(图1)。AC007271.3+SCCA、AC007271.3+TSGF以及AC007271.3+CEA联合检测对OSCC诊断价值均高于SCCA、TSGF、CEA的单独检测(图2)。其中，SCCA+AC007271.3联合检测对OSCC的诊断价值最高(AUC为0.927)，诊断灵敏度为80.6%，诊断特异度为92.5%；AC007271.3+SCCA+TSGF联合检测诊断特异度较SCCA+AC007271.3联合检测低，但其曲线下面积更具优势(AUC为0.932)(表3)；同时SCCA+AC007271.3联合检测对Ⅰ～Ⅱ期OSCC的诊断价值最高(AUC为0.960)。生存分析研究结果显示，血清中AC007271.3高表达OSCC患者预后较差(χ2=4.792，HR=2.507，95%CI=1.097～4.206,P<0.05)(图3)。

图1 血清中AC007271.3、SCCA、TSGF、CEA诊断OSCC的ROC曲线

a、b、c分别为SCCA、TSGF、CEA单独检测及其与AC007271.3联合检测的ROC曲线

图3 血清中AC007271.3表达水平与OSCC患者总生存率的关系

表3 OSCC患者血清中不同检测指标诊断价值的评估

3 讨 论

目前研究证明，lncRNA是一类位于细胞核或细胞质内，长度大于200个核苷酸的不具有可读框的转录本，在组蛋白乙酰化、基因甲基化、转录后翻译等生物学过程中发挥着重要作用，是肿瘤发生发展的关键调控因子[11-13]。同时研究表明，lncRNAs可以从肿瘤组织释放到循环系统中，在癌症患者的血液、尿液和唾液中均可检测到，由此提示一些游离lncRNA可能携带与肿瘤发生、侵袭和转移等有关的信号因子，可作为潜在的肿瘤标志物[14-18]。血清中的循环lncRNAlinc00152、CFLAR-AS1以及POU3F3均可作为人食管鳞状细胞癌发生发展的肿瘤标志物[19-21]。胃癌患者血清中的循环lncRNAAK001058、INHBA-AS1、MIR4435-2HG、UCA1和CEBPA-AS1的水平显著高于健康对照组[22]。而关于OSCC患者血清中lncRNA检测的相关报道较少。

前期研究证实，AC007271.3在OSCC组织中异常表达，由OSCC细胞进行分泌，在OSCC患者血清中稳定表达，并且手术以后OSCC患者血清中AC007271.3表达水平显著降低，是OSCC液体活检的一个潜在肿瘤标志物。本研究扩大样本量，进一步检测AC007271.3及几种传统肿瘤标志物SCCA、CEA和TSGF在研究组及对照组血清中的表达情况。结果显示，研究组患者血清中AC007271.3的表达水平显著高于对照组。进一步分析发现，AC007271.3的表达水平分别与患者吸烟史、肿瘤TNM分期、分化程度、淋巴结转移相关，并且其表达水平越高，患者预后越差，提示AC007271.3可作为OSCC诊断及预后评估的新型肿瘤标志物。这些结果与本课题组前期研究结果一致[6]，进一步提示了AC007271.3在OSCC患者精准诊断和预后评估中的价值。

目前临床诊断OSCC的肿瘤标志物较少，传统的血清标志物如SCCA、TSGF、CEA等已被用作多种肿瘤早期诊断的临床标志物[23]。研究表明，血清SCCA是一种诊断特异度较高可用于鳞癌诊断的肿瘤标志物，其血清水平与肿瘤进程相关，术后患者血清SCCA水平较术前显著降低，而50%患者血清SCCA水平升高可先于临床诊断复发，但其诊断灵敏度不高[6-7,24]。本研究中，血清中SCCA水平与OSCC患者肿瘤TNM分期、分化程度及淋巴结转移有关，ROC曲线分析提示SCCA对OSCC患者诊断特异度较高，但其诊断灵敏度欠佳，与文献中报道的结果基本一致[24]。TSGF是一种广谱肿瘤标志物，在急性炎症、胶原疾病和其他临床疾病中血清水平均较高[25]。本研究发现TSGF在Ⅲ～Ⅳ期、有区域淋巴结转移、术后病理提示肿瘤为低分化的OSCC患者血清中显著高表达。CEA也是一种广谱肿瘤标志物，但其诊断特异度不强，诊断灵敏度不高，对早期头颈部恶性肿瘤诊断价值不大[26]。本研究中血清中CEA的表达与OSCC患者临床病理特征并无明显差异。由于单项肿瘤标志物检测诊断灵敏度和诊断特异度具有一定局限性，而且传统肿瘤标志物的水平通常受到许多其他疾病和因素的影响[27]。因此，本研究又进一步采用ROC曲线分析AC007271.3及SCCA、CEA和TSGF联合检测对于OSCC患者的诊断价值，结果发现，AC007271.3+SCCA联合检测以及AC007271.3+SCCA+TSGF联合检测的价值均高于单独检测AC007271.3、SCCA和TSGF，其中，AC007271.3+SCCA+TSGF联合检测对OSCC具有较高的诊断灵敏度和诊断特异度，诊断价值最高，和本课题组前期研究结果一致[6]。这为临床OSCC患者的早期诊断和预后评估提供了一种新的策略，有利于提高对OSCC患者的早期诊断和预后评估。

综上所述，本文研究的结果提示血清中的AC007271.3、SCCA以及TSGF是OSCC患者精准诊断、治疗、预后评估的肿瘤标志物，同时联合检测AC007271.3+SCCA+TSGF可以有助于提高对OSCC患者诊断效率，可为OSCC的早期诊断、治疗及预后评估提供参考。