CTC检测在预测肺癌复发转移及患者预后中的意义

李 娜，姚 丽

(连云港市第二人民医院东院检验科，江苏 连云港 222000)

肺癌是临床上常见的恶性肿瘤，且男性发病率略高于女性，成为威胁人群健康、生命的主要疾病之一[1]。肺癌病因复杂，普遍认为与长期大量吸烟、职业、电离辐射及遗传因素有关[2]。患者发病早期临床症状缺乏典型性，随着病情的发展可表现为局部症状、全身症状、浸润和转移症状等[3]。目前，临床上对于肺癌以手术、化疗治疗为主，虽然能延缓病情发展，延长患者寿命，但是部分患者治疗后由于缺乏有效的预测指标，导致患者复发、转移率较高，难以达到预期的治疗效果[4]。循环肿瘤细胞(CTC)是指从原发病灶进入外周血液中的肿瘤细胞，但是临床上，关于CTC水平与预测肺癌的复发、转移及患者预后相关性研究较少[5]。因此，本文探讨CTC在预测肺癌复发、转移及患者预后中的应用价值，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014年4月至2015年4月治疗的肺癌患者71例作为对象，设为观察组，男41例，女30例，年龄35～88岁，平均(61.20±6.71)岁；病理类型：鳞癌25例，腺癌27例，腺鳞癌19例；肿瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期37例；分化程度：低分化23例，中分化36例，高分化12例。纳入标准：(1)均符合肺癌临床诊断标准[6]，均经病理组织检查确诊；(2)所有患者均为初次诊断，能在医生指导下完成有关检查与治疗。选择同期在本院体检健康者55例，设为对照组，男30例，女25例，年龄34～87岁，平均(60.28±6.69)岁。排除标准：(1)合并其它肺部疾病或其它恶性肿瘤者；(2)合并精神异常、认知功能障碍、自身免疫系统疾病或凝血功能异常者；(3)近期使用其它方法治疗或影响预后评估者。两组临床资料均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 仪器与设备

Abbott i2000全自动免疫分析仪(雅培公司)、常温台式离心机(型号：TDL-40C)(上海安亭仪器公司)、Promax摇床(德国海盗尔夫Heidolph公司)、GL-802B型微型台式真空泵(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、荧光显微镜(上海顺宇科技有限公司)、原位杂交仪(美国Westwood公司)、DAPI荧光保存液(赛特生物医药科技有限公司)、Triton X-100(上海波光生物科技有限公司)。

1.3 循环肿瘤细胞富集方法

1.3.1 标本采集 观察组患者均为初次诊断后入院治疗，分别于治疗前和治疗完成后，采集患者早晨空腹静脉血10 mL，对照组健康体检当天空腹状态下取静脉血10 mL，并放置在含EDTA的抗凝管中备用。

1.3.2 磁珠富集 取淋巴细胞分离液与血液标本，混合后进行加热，控制加热温度为18～25 ℃，充分混合抗凝血7.5 mL及等量PBS液，经贴壁后缓慢导入淋巴细胞分离层，常温下进行20 min离心，离心力1463 g，获得环状乳白色单个核细胞层，采用PBS清洗2次，15 min离心，离心力1463 g。将细胞沉淀悬浮在磁珠缓冲液80 μL中，向缓冲液中加入CD45抗体20 μL，充分混合后进行15 min孵育，温度为4 ℃，加入磁珠缓冲液2 mL，10 min离心，离心力1463 g。去除上层清液，向获得的细胞沉淀中加入缓冲液500 μL完成细胞重悬，经磁珠MS分流柱后加入磁珠缓冲液500 μL，采用MS分流柱进行2次清洗。取分流柱分流出的液体，10 min离心，离心力1463 g后去除上清，将细胞沉淀放置在防脱载玻片中风干，在浓度为4%多聚甲醛中固定，见图1[7]。

图1 循环肿瘤细胞富集过程部分示意图

1.4 荧光染色

利用PBS对制备的载玻片进行3次清洗，每次清洗5 min，清洗完毕后采用BAS进行0.5 h封闭，然后，再用PBS清洗3次，每次5 min。向获得的溶液中加入小鼠抗人广谱细胞角蛋白，4 ℃下过夜，PBS清洗3次，每次5 min，然后向溶液中加入小鼠IgG(采用FITC标记)，常温下孵育120 min，PBS清洗3次，每次5 min。在细胞区域加入DAPI感染的细胞核7 μL，加入盖玻片封固，在免疫荧光显微镜下观察、拍照[8-9]。

1.5 复发转移及预后评估

统计观察组患者的性别、年龄、肿瘤病理类型、肿瘤分期、转移、复发、预后等资料，分析CTC阳性率与患者临床病理特征和预后、复发、转移的关系。

患者预后情况采用recist标准评价[10]：①完全缓解(CR)：病灶全部消失；②部分缓解(PR)：病灶范围较前缩小30%以上；③疾病稳定(SD)：病灶范围缩小不超过30%，增大小于20%；④疾病进展(PD)：病灶范围增大超过20%或出现新发的转移灶或远处转移灶。将CR、PR归为预后良好，将SD、PD归为预后一般。CT和MRI等影像学检查发现原发病灶和局部有新的病灶出现定义为肺癌复发，当发现大脑或肝脏、脾脏、骨骼等其它部位转移病灶时定义为肺癌转移。

1.6 统计分析

2 结 果

2.1 两组CTC阳性率比较

观察组有39例发现CTC阳性，CTC阳性率为54.93%，对照组有2例CTC阳性，CTC阳性为3.64%，差异有统计学意义(P<0.05)，说明肺癌患者外周血CTC阳性率高于健康人群。

2.2 CTC阳性率与患者临床病理特征和预后、复发、转移的关系

肺癌患者CTC阳性率与肿瘤分期、分化程度、预后、复发及转移有关，Ⅲ～Ⅳ期肿瘤、低分化程度、预后一般、存在复发转移的患者，其CTC阳性率明显大于Ⅰ～Ⅱ期肿瘤、中高分化程度、预后良好、不存在复发转移的患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。肺癌患者CTC阳性率与性别、年龄、病理类型无关，不同性别、年龄和病理类型的患者，其CTC阳性率比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3 肺癌患者复发、转移及预后与CTC阳性率相关性

Pearson相关性分析结果表明：肺癌患者复发、转移与CTC阳性率呈正相关性(P<0.05)；肺癌患者预后与CTC阳性率呈负相关性(P<0.05)，见表2。

3 讨 论

目前，临床上对于肺癌以手术治疗、放化疗为主，手术能有效的切除病灶组织，延长患者寿命[11]；放化疗则能杀死肿瘤组织，控制病情持续发生。但是，无论何种治疗方法均存在明显的局限性，再加上患者治疗后由于缺乏有效的预后评估指标，导致患者死亡率、复发率较高，影响患者预后[12]。

表1 39例CTC阳性患者临床病理特征和预后、复发、转移的关系

表2 肺癌患者复发、转移及预后与CTC阳性率相关性

目前临床上对于肺癌的诊断、预后和复发转移的判断主要依靠CT、MRI等影像学检测以及病理活检手段，然而这些手段对于微小病灶的检出能力有限，很难做出准确的判断，而且在肺癌的治疗过程中很难实现动态监测。CTC不同于影像检查和病理诊断，只需要通过采集外周血即可获取，所以能够实现动态监测，在肺癌的治疗过程中，可通过CTC的动态变化来评估治疗效果，从而及时调整肺癌的治疗方案。此外CTC在肺癌复发转移的风险评估中也有重要作用，影像学检测是无法判断患者复发转移的风险，当能够检测到病灶存在时实际上已经发生了复发转移。而CTC则不同，肿瘤的复发转移主要就是通过血液系统传播的，可以通过检测血液中的CTC，提前评估复发转移的风险。

本研究中，观察组肺癌患者中CTC阳性率显著高于对照组，说明CTC在肺癌患者中阳性率较高，能参与疾病的发生、发展。CTC最早在19世纪首次提出，后经不断研究探索发现其存在于恶性肿瘤患者外周血循环中，且在良性疾病或健康人群中水平较低。对于肺癌患者而言，肿瘤细胞可自发，亦可由于治疗过程中挤压、器械触碰等进入血液中[13]。部分CTC进入外周循环中可以通过机体免疫识别及自然杀伤细胞作用而凋亡，仅有极少数CTC能逃避免疫监视存活，并且通过迁移、相互聚集、黏附等方式形成微小癌栓，在特定的作用下演变为转移灶，从而影响患者预后。本研究中，观察组肺癌组织中CTC阳性率与肿瘤分期、分化程度、预后、复发及转移具有统计学意义(P<0.05)，说明CTC在肺癌患者中水平受到的影响因素较多，加强CTC细胞测定能反应患者的疾病严重程度。临床研究表明[14]：对于肺癌患者而言，CTC检测对预测患者预后具有更高的敏感性，它能对患者疾病严重程度和治疗效果进行准确评估[15]。本研究中，Pearson相关性分析结果表明：肺癌患者复发、转移与CTC阳性率呈正相关性(P<0.05)；肺癌患者预后与CTC阳性率呈负相关性(P<0.05)，说明CTC细胞阳性率与患者的预后、转移及复发存在紧密的联系。

综上所述，CTC在肺癌患者中阳性率较高，能预测患者复发、转移，有助于评估患者预后，能为临床治疗方案的调整提供依据和参考。