高效液相色谱法测定甘草、黄芪和葛根中除草剂氟磺胺草醚和氯嘧磺隆的残留量

季 磊，马晓健， 曲悠扬， 戚 骥

(大连市检验检测认证技术服务中心，辽宁 大连 116630)

随着我国中医药事业的发展，药用植物的种植技术也在不断提高。在药用植物的种植过程中，杂草会争夺养料、水分和空间，影响药用植物的生长。使用化学除草剂可以高效、高质量消灭杂草。氟磺胺草醚和氯嘧磺隆是豆科药用植物种植时常用的苗后除草剂[1][2]。氟磺胺草醚是一种二苯醚类化合物，可被杂草叶片、根部吸收，破坏光合作用，使杂草叶片黄化，迅速枯萎死亡，主要用于豆科植物除草，能防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草。氯嘧磺隆是磺酰脲类除草剂，通过根部传导至生长点发挥作用，抑制敏感植物生长，主要用于防除莎草、阔叶杂草及某些禾本杂草。这两种除草剂在土壤中残效时间都较长[3][4]，容易对生态环境造成危害[5][6]，也会对后茬作物产生药害[7][8]，甚至有研究表明，氟磺胺草醚对人类和动物也存在潜在的威胁[9]。目前，有关氟磺胺草醚残留量的研究大部分选用的研究对象为大豆、花生和土壤，氯嘧磺隆残留量的研究选用的研究对象多为大豆、土壤和甜菜，使用的检测方法包括高效液相色谱法[10][11]、液相色谱-质谱联用法[12～14]以及气相色谱-质谱联用法[15][16]等。本研究使用高效液相色谱-紫外检测法建立甘草、黄芪和葛根中氟磺胺草醚和氯嘧磺隆残留量的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 高效液相色谱仪Alliance 2695/2996，美国沃特世Waters；色谱柱Poroshell EC-C18(2.7μm，4.6mm×100mm)，美国安捷伦Angilent；N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂，天津博纳艾杰尔科技有限公司；C18吸附剂，天津博纳艾杰尔科技有限公司；电子天平BSA224S，德国赛多利斯Sartorius；超纯水系统，德国赛多利斯Sartorius；旋涡混合器XW-80A，上海精科实业有限公司；24位氮吹仪，美国Organomation；

甲醇中氟磺胺草醚溶液(含量：100μg/mL，批号：A2002182)，北京坛墨质检科技有限公司；甲醇中甲醇中氯嘧磺隆(含量：100μg/mL，批号：202001)，农业部环境保护科研监测所；甲醇、乙腈、磷酸，色谱纯。

1.2 测定方法

1.2.1 样品处理 分别取甘草、黄芪和葛根样品，粉碎至粉末状态(过40目筛)，混匀。称取3g样品于离心管中，加入4mL水，旋涡混合器震荡混匀，浸泡60min。加入15mL乙腈，旋涡混合器震荡2min，加入1.5g氯化钠，再次用旋涡混合器震荡2min，10 000r/min离心4min。取上清液10mL于另一离心管中，35℃氮气吹至近干，用乙腈定容至2mL。加入0.6gPSA、0.3gC18和1g无水硫酸镁，旋涡混合器震荡2min，10 000r/min离心4min，上清液过0.22μm微孔滤膜，待测。

1.2.2 液相色谱检测条件 色谱柱为Poroshell EC-C18(2.7μm，4.6mm×100mm)，柱温30℃，进样量10μL；紫外检测器波长285nm；流动相A为0.02%磷酸-水溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度(表1)。

2 结果

2.1 标准曲线 分别取100μg/mL的氯嘧磺隆溶液和100μg/mL的氟磺胺草醚溶液各500μL，用甲醇稀释至50mL，配制成1μg/mL的标准储备溶液。分别取200μL、500μL、1mL、1.5mL、2mL和3mL的标准储备溶液，用乙腈-水溶液(1：9)定容至10mL，配制成浓度为20、50、100、150、200和300ng/mL的标准溶液，绘制标准曲线。溶液浓度(ng/mL)为横坐标x，色谱峰面积为纵坐标y，化合物线性关系良好，相关系数>0.999。所得曲线和相关系数(图1)。

图1 标准曲线及相关系数

2.2 回收率试验及定量限 分别取甘草、黄芪和葛根样品加入适量的标准溶液，每个浓度6个平行，经1.2.1处理后测定，计算回收率和相对标准偏差(RSD)。经计算，当氯嘧磺隆和氟磺胺草醚的添加量为20μg/kg时，测定结果信噪比S/N>10，回收率>86%，相对标准偏差<9%，本方法中氯嘧磺隆和氟磺胺草醚的定量限均确定为20μg/kg。添加回收试验中，氯嘧磺隆回收率在86.3%～98.9%之间，相对标准偏差(RSD)<9%，氟磺胺草醚回收率在91.5%～98.2%之间，相对标准偏差(RSD)<8%。样品添加量和结果(表2)，色谱图(图2)。

表2 样品添加量、回收率和相对标准偏差

图2 三种基质的空白样品色谱图及加标样品色谱图(①氯嘧磺隆 ②氟磺胺草醚)

3 讨论

3.1 检测器波长的选择 将氯嘧磺隆和氟磺胺草醚配制成1μg/mL的混合标准溶液，在不同的检测波长条件下进行扫描。经比较发现，波长285nm条件下，氯嘧磺隆和氟磺胺草醚都有较大响应且干扰较少。

3.2 样品处理方法的选择 本次研究考察了使用QuEChERS法[17][18]和固相萃取柱处理样品的净化效果。

方案一，使用QuEChERS法净化样品。由于样品含水较少，取3g样品加入4mL水浸泡60min，再加入6mL乙腈、1.5g氯化钠，充分混合，离心后取4mL上清液于另一离心管中，加入0.6gPSA、0.3gC18和1g无水硫酸镁混合后再次离心，取上清液待测。

方案二，使用C18固相萃取柱净化样品。3g样品加入20mL乙腈-水溶液(1：9)提取并离心，取10mL上清液过经过活化的C18固相萃取柱(200mg，3mL)，3mL乙腈-水溶液(2：8)淋洗，用2mL乙腈-水溶液(8：2)洗脱，收集滤液待测。

经比较，使用QuEChERS法处理样品的回收率优于使用固相萃取柱净化。为了使定量限更低，本方法最后选择使用乙腈提取后浓缩提取液，再加入PSA和C18净化样品。通过比较PSA和C18不同用量的净化效果，PSA用量≥0.6g，C18用量≥0.3g时，不同样品的净化效果都能达到最佳，所以本方法使用0.6gPSA和0.3gC18净化样品。

3.3 液相色谱条件的选择 本次研究比较了使用不同比例的甲醇、乙腈、水和0.02%磷酸[19]作为流动相，化合物色谱图的峰面积、峰高、保留时间和分离度等因素。当使用甲醇作有机相时，化合物与杂质峰分离效果不好；使用乙腈-水流动相时，氯嘧磺隆出峰效果良好，但是氟磺胺草醚峰形不好；使用乙腈-0.02%磷酸流动相时，因为氯嘧磺隆在酸性条件下不稳定，色谱峰的峰面积略微减小，氟磺胺草醚出峰效果好，容易与杂质分离。综合考虑不同流动相条件下不同化合物的检测结果，同时也为了缩短检测时间，本方法使用乙腈-0.02%磷酸流动相梯度洗脱。

4 结论

本次研究使用高效液相色谱建立了甘草、黄芪和葛根中除草剂氯嘧磺隆和氟磺胺草醚残留量的检测方法。所使用的试剂用量少，操作相对简单方便，测定结果满足NY/T 788-2018标准要求[20]，可以快速大量的对样品进行筛选的同时进行准确定量。