smad1/5信号通路在诱导多能干细胞成釉分化中的作用研究

刘 治 覃文聘 高 鹏 谭 蕾 张乐琪

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem，iPS)被认为是实现牙齿再生的一种新的干细胞来源，其来源于患者自体成熟细胞，因此成功克服了细胞来源受限、伦理和免疫排斥上的障碍，具有良好的临床应用前景。研究显示，iPS细胞可被诱导分化为神经细胞、胰岛素分泌细胞、心血管和造血细胞、肝脏、肾脏等细胞[1]。Liu等[2]近期研究表明，iPS细胞可在成釉细胞无血清条件培养基(ameloblast serum-free conditioned medium，ASF-CM)诱导下，分化为成釉细胞样细胞，并表达成釉细胞标志物成釉蛋白(ameloblastin，AMBN)及细胞角蛋白-14(cytokeratin-14，CK14)；当在ASF-CM中添加骨形态发生蛋白4 (morphogenetic protein 4，BMP4)可显著促进iPS细胞的成釉分化，而加入了BMP抑制剂noggin则可显著抑制iPS细胞的成釉分化，表明BMP家族分子在iPS细胞成釉分化过程中发挥关键调控作用。然而，iPS细胞成釉分化过程中的信号转导通路目前仍不清楚。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)属于转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)家族成员，是一组能广泛参与调节多种细胞的增生、迁移、分化和凋亡的生物学过程的功能蛋白，其在早期胚胎发生和随后的器官形成中发挥关键调控作用。BMP信号通过激活其受体磷酸化smad1、5、8蛋白，从而启动细胞内信号转导，继而直接或间接通过 DNA 结合蛋白或重新合成蛋白质来调节靶基因的转录。此外，有研究显示BMPs也可直接激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)通路，其中，ERK1/2信号转导通路主要调控细胞生长与分化，JNK和 p38 MAPK 信号转导通路参与炎症、细胞凋亡等应激反应[3]。然而，smad与MAPKs信号通路在iPS细胞被诱导向成釉细胞分化过程中的调控作用，目前仍未见文献报道。

本研究采用ASF-CM诱导iPS细胞成釉分化，检测分化过程中smad1/5与MAPKs信号分子磷酸化水平，并观察smad1/5或MAPKs通路抑制剂对iPS成釉分化的影响，从而探明smad1/5与MAPKs信号通路在iPS细胞成釉分化中的作用。

材料与方法

1.实验材料:小鼠C5系iPS细胞购自中国科学院广州生物医药与健康研究院。成品上皮细胞培养液购自美国Sciencell公司，smad1/5通路抑制剂LDN-193189购自美国Selleck公司，p38 MAPK通路抑制剂SB203580及ERK1/2通路抑制剂U0126，以及phospho-smad1/5、phospho-p38、total-p38、phospho-ERK1/2、total-ERK1/2、phospho-JNK、total-JNK及GAPDH抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。RIPA细胞裂解液及BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司，RNeasy Mini kit试剂盒购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒(DRR037A)及SYBR法实时定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，Oct-4、SSEA-4、SSEA-1、AMBN、ENAM和CK14抗体均购自美国Santa Cruz 生物技术公司，MTT检测试剂盒(C0009)购自上海碧云天生物技术公司。

2.实验方法:分离培养小鼠胚胎成纤维细胞:将怀孕12.5～14.5天 C56孕鼠断颈处死，无菌条件下取出胎鼠，小心分离其躯干并置于盛有PBS的平皿内，充分洗涤弃除红细胞。用无菌眼科剪剪碎鼠胚躯干,加适量胰酶37℃消化30min后终止消化，常规离心弃上清，加适量含10%胎牛血清的DMEM培养液，反复吹打后接种置细胞培养瓶中，37℃、5%CO2、饱和湿度培养，培养6天后传代。

3.制备iPS细胞滋养层:将丝裂霉素(10μg/ml)加入到上述长满胚胎成纤维细胞的培养瓶中孵育3h，吸弃废液PBS充分洗涤后，加入0.25%胰酶消化。在显微镜下观察，当贴壁细胞层出现裂隙且有少量细胞漂浮时，用移液管反复吹打瓶底，加含血清培养液终止消化，常规离心后弃上清，以3.0×104/cm2密度铺在经0.1%明胶溶液预处理的培养瓶中，于培养箱中静置过夜，使细胞贴壁。铺好的饲养层在7 天内可有效支持iPS细胞的生长并维持其全能性。

4.培养小鼠iPS细胞:于37℃水浴中迅速解冻iPS细胞，将细胞悬液吸至加有少量PBS的离心管中，常规离心弃上清，加入6ml含10%胎牛血清的DMEM培养液，吹打混匀为单细胞悬液，并移至已铺好饲养层细胞的培养瓶中，37℃、5%CO2、饱和湿度培养，每天换液，观察克隆的大小和密度，一般在培养后的第3 天可进行传代。

5.成釉细胞无血清条件培养基(ASF-CM)的制备:断颈处死出生7天的C57 仔鼠20只，无菌分离仔鼠下颌骨， PBS冲洗干净后分离其下颌切牙牙胚，在体视学显微镜下用显微镊剥离成釉上皮，浸泡于含 10%胎牛血清的DMEM培养液中。剪碎组织后加入2ml Ⅰ型胶原酶，于37℃消化1h，终止消化后常规离心，弃上清，加入无血清的上皮细胞培养液，以1×105/ml密度接种于培养瓶内，37℃、5%CO2、饱和湿度培养。待细胞贴壁后，采用差别消化法纯化上皮细胞，首先加入0.25%胰酶消化细胞5min，倒置显微镜下观察到成纤维样细胞完全脱壁，此时加入含血清培养基终止消化，PBS反复冲洗后加入无血清的上皮细胞培养液继续培养。可重复此法，直至贴壁的完全是上皮细胞而没有成纤维细胞。当成纤维样细胞全部去除后，开始收集成釉细胞无血清条件培养液(ASF-CM)，避光条件下用无血清上皮细胞培养液每天换液1次，置换出来的ASF-CM用小滤器过滤后-80℃冷藏备用。为确保实验的可重复性，将所有ASF-CM混匀后分装，用于下述实验。

6.iPS细胞诱导分化及通路阻断:以1∶1体积比配制ASF-CM与iPS常规培养液混合液(ASF-CM)，分别在上述混合液中加入200nmol/L LDN-193189(smad1/5通路抑制剂)，或10μmol/L SB203580 (p38 通路抑制剂) 或 10μmol/L U0126 (ERK1/2通路抑制剂)，采用ASF-CM或加入上述通路抑制剂的ASF-CM培养iPS细胞，2天换液1次，以常规iPS培养液培养作为阴性对照，培养14天后收集细胞，进行下述蛋白及基因检测。

7.Western blot法检测蛋白表达量：RIPA裂解细胞30min，4℃高速离心取上清，BCA蛋白定量法测定样品总蛋白浓度；取各组蛋白样品40μg用体积分数为10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行凝胶电泳后，再以半干法转印到PVDF膜上，5.0%脱脂牛奶封闭 1h，然后分别加兔抗小鼠phospho-smad1/5、GAPDH、phospho-p38、total-p38、phospho-ERK1/2、total-ERK1/2、phospho-JNK及total-JNK一抗(1∶1000，美国Cell Signaling Technology公司)，4℃孵育过夜；TBST洗膜后，滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶5000，北京中杉金桥生物技术公司)室温孵育1h；TBST再次洗膜后，ECL化学发光试剂显影，化学发光凝胶成像系统检测蛋白条带，并计算蛋白的相对表达水平。

8.实时定量PCR:RNeasy Mini kit试剂盒提取样品总RNA，反转录试剂盒反转录合成cDNA，再以cDNA为模板，以GAPDH为内参照，采用SYBRⅡ试剂盒检测各组细胞Ambn、ENAM及Ck14 mRNA的表达水平，反应条件严格按产品说明书进行；所用引物均由日本TaKaRa公司合成，具体引物序列见表1。最后以目的基因与 GAPDH 的起始拷贝数的比值表示目的基因的相对表达量。实验重复3次。

9.免疫荧光染色：4%多聚甲醛固定细胞15min，PBS洗后滴加0.25% Triton X-100，37℃孵育15min，PBS洗后加入4%山羊血清孵育30min，不冲洗，甩干后直接加入相应一抗 (1∶100)，4℃孵育过夜；PBS洗3次， 滴加FITC或Rhodamine标记的二抗(1∶200)，37℃避光孵育30min；5μg/ml DAPI衬染细胞核2min，Olympus 荧光显微镜观察及DP Manager软件处理图。

表1 PCR引物序列

10.MTT实验:分别在上述阻断实验进行1、7、14天时，在细胞培养孔中加入MTT 溶液(5mg/ml)20μl，继续孵育4h，每孔加入100μl Formazan溶解液并混匀，继续孵育使结晶物充分融解，选择 570nm 波长，在酶标仪上测定各孔吸光度值，记录结果。

11.统计学方法：采用SPSS 11.0统计学软件对数据进行方差分析，采取盲法获取及计算以上数据，即由两个对实验设计不了解的实验员各计数2次，并间隔1周。经标准一致性检验显示，两人所得数据高度吻合(r>0.9)，因此两人计数的平均值被用于统计分析。采用SNK-q检验进行两两亚组间比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.Western blot法检测：用于实验的ips细胞表达胚胎干细胞特异性标记分子SSEA-4及Oct-4，阳性细胞百分比均高于95%，但不表达分化的胚胎干细胞标志物SSEA-1(图1)，表明其具有胚胎干细胞样特性。本实验采用Western blot法检测磷酸化的smad1/5及MAPKs通路分子的表达。结果显示，经ASF-CM处理的iPS细胞p-smad1/5 (6.1±1.3)、p-P38 (3.2±0.6)以及p-ERK1/2 (4.1±0.8)的表达较对照组显著升高(图2、图3)，但其p-JNK表达水平与对照组比较，差异无统计学意义(t=0.67，P=0.61)。

图1 iPS细胞免疫荧光染色及阳性细胞定量(×40)Oct-4与SSEA-4为胚胎干细胞特异标记分子，SSEA-1为分化的胚胎干细胞标志物

图2 Western blot法检测及定量对照培养基或ASF-CM培养iPS细胞后p-smad1/5蛋白表达水平与对照组比较，*P<0.01

2.实时定量PCR结果：分别将smad1/5、P38以及ERK1/2信号通路抑制剂加入到ASF-CM中培养iPS细胞14天，并以对照培养基或ASF-CM培养的iPS细胞作对照，检测iPS细胞成釉细胞特异性标志物(Ambn、ENAM和Ck14)基因的表达。对照组、ASF-CM组、ASF-CM+LDN-193189组、ASF-CM+SB203580组及ASF-CM+U0126组iPS细胞Ambn(F=4.290，P<0.05)、ENAM(F=3.620，P<0.05)和Ck14(F=3.110，P<0.05)的表达比较，差异有统计学意义，其中ASF-CM组iPS细胞Ambn(6.6±1.3)、ENAM(5.4±0.9)和Ck14 mRNA(5.9±1.1)的表达较对照组显著增高(P<0.05)，smad1/5抑制剂LDN-193189可显著反转ASF-CM的上述促iPS细胞成釉分化的效应，表现为ASF-CM+LDN-193189组iPS细胞Ambn(2.4±0.5)、ENAM(1.9±0.6)和Ck14 mRNA(1.4±0.4)的表达较单纯ASF-CM组显著降低(P<0.05，图4)，但仍旧高于对照组(P<0.05)。然而，p38 MAPK通路抑制剂SB203580及ERK1/2通路抑制剂U0126则对ASF-CM促iPS细胞成釉分化的效应无显著影响，表现为ASF-CM+SB203580组及ASF-CM+U0126组iPS细胞Ambn(SB203580组：6.1±1.1；U0126组：5.9±0.8)、ENAM(SB203580组：4.8±0.9；U0126组：5.1±0.5)和Ck14 mRNA(SB203580组：5.3±1.2；U0126组：4.9±0.6)的表达与单纯ASF-CM组比较，差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

图3 Western blot法检测及定量对照培养基或ASF-CM培养iPS细胞后MAPKs通路分子蛋白表达水平与对照组比较，*P<0.01

3.免疫荧光染色结果：采用对照培养基培养的iPS细胞基本不表达成釉细胞特异性标志物Ambn、ENAM及Ck14，ASF-CM组及ASF-CM+抑制剂组iPS细胞均可表达Ambn、ENAM及Ck14蛋白，主要表达在胞核及胞质(图4)。定量研究结果显示对照组、ASF-CM组、ASF-CM+LDN-193189组、ASF-CM+SB203580组及ASF-CM+U0126组iPS细胞Ambn(F=44.190，P<0.05)、ENAM(F=52.160，P<0.05)和Ck14(F=40.680，P<0.05)阳性细胞百分比组间比较，差异有统计学意义，其中ASF-CM组iPS细胞Ambn(46.6±11.3)、ENAM(51.4±10.9)及Ck14(41.9±8.1)阳性细胞百分比均较对照组显著增高(P<0.05)，smad1/5抑制剂LDN-193189可显著逆转ASF-CM诱导iPS细胞成釉分化的作用，表现为ASF-CM+LDN-193189组iPS细胞Ambn(8.4±0.5)、ENAM(6.9±0.6)和Ck14 (4.4±0.4)阳性细胞百分比均较单纯ASF-CM组显著降低(P<0.05)，但仍高于对照组(P<0.05)。ASF-CM+SB203580组及ASF-CM+U0126组iPS细胞Ambn(SB203580组：44.1±8.1；U0126组：45.9±8.8)、ENAM(SB203580组：49.8±10.9；U0126组：50.1±7.5)和Ck14(SB203580组：38.3±9.2；U0126组：40.9±10.6)阳性细胞百分数与单纯ASF-CM组比较，差异无统计学意义(P>0.05，表3)。

表2 实时定量PCR检测

图4 免疫荧光染色观察(×40)

表3 免疫组化半定量比较

4.MTT结果：不同培养基组在不同时间下A值差异有统计学意义(不同培养基因素F=2.12，P<0.05，时间因素F=5.33，P<0.05，交互效应F=3.01，P<0.05)。采用对照培养基或ASF-CM培养iPS细胞1天(对照组：0.20±0.03；ASF-CM组：0.18±0.02)及7天(对照组：0.50±0.10；ASF-CM组：0.46±0.14)，两组间iPS细胞增生活动在不同时间点比较差异均无统计学意义(P>0.05)，当培养14天时，ASF-CM组iPS细胞增殖活动较对照组显著降低(对照组：0.78±0.06；ASF-CM组：0.56±0.11；P<0.05)。然而，在ASF-CM组中加入smad1/5、P38或ERK1/2信号通路抑制剂组iPS细胞增殖活动与单纯ASF-CM组细胞在1、4、7天比较，差异无统计学意义(P>0.05,图5)。

图5 MTT实验检测

讨 论

用于牙齿再生的干细胞主要包括牙源性干细胞和非牙源性干细胞，前者包括牙髓干细胞、牙周膜干细胞及脱落乳牙干细胞等，但由于患者特异性的牙源性干细胞的来源及细胞数量有限，限制了其在临床上的广泛应用[4～6]。非牙源性干细胞包括骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞及iPS细胞等，其中骨髓间充质干细胞仍存在来源有限的问题[7];而胚胎干细胞长期受着伦理上的争议以及免疫排斥的缺陷，也不适合应用于临床治疗[8,9]。

本实验所采用的iPS细胞来源于成熟体细胞，因此克服了细胞来源受限、伦理和免疫排斥上的障碍，具有良好的临床应用前景[1]。Arakaki等[10]通过分离小鼠下切牙根尖端颈环组织构建了牙源性上皮细胞系，并将该上皮细胞与鼠源性iPS细胞共培养，结果显示上皮细胞可显著诱导iPS细胞分化为成釉细胞样形态，并表达Ambn、ENAM及Ck14等多种成釉细胞标志物；然而，Yoshida等[11]研究发现，相较于将Malassez上皮剩余细胞与iPS细胞共培养，采用Malassez上皮剩余细胞的条件培养基培养iPS细胞能够更有效地诱导其形成成釉细胞样细胞。Liu等[2]证明了成釉细胞无血清条件培养液(ASF-CM)可高效诱导iPS细胞向成釉细胞方向分化，表达成釉细胞标志物Ambn及Ck14。本实验结果显示ASF-CM 培养iPS细胞14天后，其成釉细胞标志物Ambn、ENAM和Ck14基因和蛋白表达水平均较对照组增高，这与Liu等[2]之前的结果一致。这些结果表明，利用成釉细胞条件培养基培养iPS细胞可诱导其分化为更接近成釉细胞的成熟细胞。牙齿的发育和形成是非常复杂生理过程，受到多种生长因子的调控，而这种动态过程不太可能仅由某种因子进行控制[12～15]。因此,本研究采用ASF-CM诱导iPS细胞成釉分化,已有实验证实ASF-CM包含BMPs、TGF-βs、Notch 1、纤维细胞生长因子等多种细胞因子[2,16～18]。然而，本研究并未鉴定本实验所采用的ASF-CM中的活性细胞因子成分，为了保证实验结果的重复性，实验中将所获得的ASF-CM混合在一起用于后续实验，从而确保实验的可重复性，后续实验可采用ELISA检测法鉴定ASF-CM中的活性细胞因子成分。

研究显示，BMPs是有效诱导iPS细胞分化的必要生长因子[19]。尽管smad1/5的激活被认为是BMPs经典信号转导通路,但研究显示BMPs亦可激活MAPKs信号通路，包括p38 MAPK、ERK1/2及JNK[20]。本实验结果显示，成釉细胞条件培养基培养iPS细胞14天后，可显著促进磷酸化smad1/5、P38和ERK1/2分子的表达，表明上述通路被激活。进一步信号通路抑制剂阻断实验结果显示，仅smad1/5抑制剂LDN-193189可显著反转ASF-CM促iPS细胞成釉分化的效应，而p38 MAPK及ERK1/2通路抑制剂对ASF-CM促iPS细胞成釉分化的效应均无显著影响。上述结果表明smad1/5信号通路在ASF-CM诱导的iPS细胞的成釉分化过程中发挥主要调控作用。后期实验中应采用体内功能验证实验进一步证实smad1/5信号通路在iPS细胞成釉分化过程中的作用。

P38 MAPK通路已被证实在BMP2及BMP7介导的牙齿发育中发挥重要调控作用[21,22]。例如调控胚胎期釉质结节p21的表达，以及成釉细胞成釉蛋白、釉质素及整合素-4的表达；外胚层P38敲除小鼠则表现出牙釉质缺陷和牙尖缺失[23]。ERK 1/2通路被证实在TGF-β1介导的组织增长，胶原蛋白改建以及牙源性干细胞分化发挥关键调控作用。由于ASF-CM中含有BMP2、BMP7、TGF-β1等细胞因子，本实验在后续研究中将进一步探明P38及ERK 1/2通路在ASF-CM诱导iPS细胞成釉分化中的作用。

综上所述，本研究结果显示smad1/5信号通路在ASF-CM诱导的iPS细胞成釉分化过程中发挥关键调控作用。后期需要体内实验进一步证实smad1/5信号通路对iPS细胞成釉分化的影响及相关机制。