不同运动强度对去势大鼠骨质疏松软骨形态的影响

文武 侯铁奇

1.宜春学院体育学院，江西 宜春 336000 2.中山大学附属第三医院，广东 广州 510630

骨质疏松症是基于每单位体积内骨量低于人体正常值、骨骼强度下降及脆性增加为主要临床特点[1]。临床表现为骨有机成分生成不足，从而引起骨组织结构发生变化，且多发生在绝经后女性及老年人群中。文献报道显示[2]，40岁以上人群中男、女骨质疏松及骨量减少症比例上存在明显差异，且骨质疏松症女性发生率为19.9%，男性发生率为11.5%。而60岁以上人群骨质疏松症发生率为28.6%，男性为15.0%，严重影响患者健康。由此看出，随着我国居民年龄的增加，女性骨质疏松症及骨量减少发生率均有所提高，可能与女性卵巢功能减弱、衰退及雌激素水平减少有关，引起体内骨量丢失，增加疾病发生率[3]。研究表明[4]，适当的运动有助于骨质疏松症状改善，能锻炼能维持正常的关节软骨形态结构及生理功能，但是临床上对于运动强度缺乏报道。国外学者研究显示[5]，女性在绝经早期肌力下降容易引起骨量下降，容易增加骨质疏松症状。患者如果在绝经早期进行运动锻炼，能有效降低骨量丢失，提高骨密度，从而降低骨质疏松发生率[6]。

1 材料和方法

1.1 材料

取SD大鼠40只，12周龄，雌性，体重290～340 g，平均(318±16)kg，所选动物均由中山大学附属第三医院动物实验中心提供。实验过程中对SD大鼠饲养、处理均符合《关于善待实验动物的指导下意见》[7]相关规则，动物质量合格证号SCXK2004-0006-152。所有试验均通过医院动物委员会批准同意。40只SD大鼠根据处理方法不同分为模型对照组、低强度组、中等强度组及高强度组，每组10只。取同期实验的SD健康大鼠10只，作为假体手术组。

1.2 方法

去势SD大鼠骨质疏松模型建立：空白组大鼠不采取任何措施处理，其余SD大鼠进行7 d适应性饲养后，采用10.0%水合氯醛根据体重0.3 mL/100 g腹腔内注射麻醉，大鼠背部1/3部位剪毛，采用碘酒进行局部皮肤消毒，沿着背部腰椎正中向下作长为2～3 cm切口，将皮肤牵向一侧，切开筋膜，进入腹膜后在子宫角上采用线完成输卵管结扎，切断输卵管，将卵巢提起，利用丝线结扎周围相连组织，将大鼠卵巢切除，缝合腹膜切口，采用同样的方法完成对侧输卵管切断及卵巢切除，缝合皮肤切口，见图1。

图1 去势SD大鼠骨质疏松模型建立 A：卵巢摘除手术；B：摘除双侧卵巢。Fig.1 Establishment of osteoporosis model by ovariectomized SD rats. A: Ovariectomy; B: Removal of bilateral ovaries.

大鼠造模前一周采用双能 X 线骨密度仪完成大鼠骨密度的测定，大鼠在测试台上采用小动物分析软件测定大鼠的骨密度，得到未处理前的骨密度，大鼠生长3个月后采用浓度为5%按照体重为7 mL/kg水合氯醛经腹腔麻醉后采用相同的方法完成大鼠密度测定。本课题中，SD大鼠模型建立前骨密度为(0.201 1±0.012 6)g/cm2，模型建立后骨密度为(0.192 4±0.031 5)g/cm2，建模前后骨密度比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示建模成功。

去势SD大鼠骨质疏松模型处理方法：①运动前准备。术后1周后开始运动，为了让大鼠适应跑台，在正式实验开始前1周，让大鼠每天在跑步机中慢速跑步，速度10～15 m/min，每天跑步30 min，正式实验后4组大鼠均进行相应的锻炼。②运动方法。模型对照组不进行运动，常规饲养。造模成功后1周开始进行训练，低强度组进行10 m/min跑台训练，中等强度组进行20 m/min跑台训练，高强度组进行25 m/min的跑台训练，每天1 h，连续训练6周[8]。

标本的收集及保存：4组大鼠跑步完成3个月后采用脊椎脱臼法处死大鼠，取大鼠双侧后腿，钝性分离关节周围组织，充分暴露大鼠膝关节，并将双侧关节放入浓度为4%的多聚甲醛溶液中保存、待用[9]。

1.3 主要观察指标

(1)关节软骨mankin score评分及关节软骨厚度。①MMS评分。参考Modified Mankin’s(MMS)评分标准对4组SD大鼠训练6周结束后关节软骨进行评定，评定内容包括结构、细胞、潮线、血管翳形成等，得分越低，治疗效果越理想。②软骨厚度。采用显微镜对关节软骨厚度进行测量，从最厚处到最薄处[10]。(2)血清钙、磷及MMP-3水平。采用甲基百里香酚蓝比色法测定4组大鼠训练6周结束后血清钙离子水平；采用孔雀绿显色法检测4组血清磷水平；采用酶联免疫吸附试验检测MMP-3水平[11]。(3)番红O染色。训练6周结束后收集大鼠标本，制备4 μm切片，染色前采用二甲苯进行固定，常规番红O染色，倒置显微镜下观察缺损部位情况[12]。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 4组SD大鼠MMS评分及关节软骨厚度比较

中等强度组MMS评分低于低强度组、高强度组及模型对照组(P<0.05)，低强度组MMS评分低于高强度组及模型组(P<0.05)，高强度组MMS评分高于模型对照组(P<0.05)；中等强度组关节软骨厚度高于低强度组、高强度组及模型对照组(P<0.05)，低强度组关节软骨厚度高于高强度组及模型对照组(P<0.05)，高强度组关节软骨厚度低于模型对照组(P<0.05)，见表1。

表1 4组SD大鼠MMS评分及关节软骨厚度比较

2.2 4组SD大鼠血清钙、磷及MMP-3水平比较

中等强度组血清钙、血清磷水平低于低强度组、高强度组及模型对照组(P<0.05)，低强度组及高强度组血清钙、血清磷水平低于高强度组及模型对照组(P<0.05)，低强度组血清钙、血清磷水平低于高强度组(P<0.05)；低强度组与中等强度组MMP-3水平差异无统计学意义(P>0.05)，低于模型对照组(P<0.05)；高强度组MMP-3水平高于低强度组、中等强度组及模型对照组(P<0.05)，见表2。

表2 4组SD大鼠血清钙、磷及MMP-3水平比较

2.3 4组SD大鼠番红O染色比较

番红O染色结果显示，模型对照组软骨表面光滑，呈圆形或椭圆形；低强度组大鼠人软骨表面相对光滑，细胞数量相对较多，排列规则，染色加深；中载荷运动组软骨表面光滑，染色明显增粗，基质染色较深，染色均匀；高强度组潮线不规则，染色相对较浅，见图2。

图2 4组SD大鼠番红O染色比较(×400)Fig.2 Comparison of safranine O staining among 4 groups of SD rats(×400)

3 讨论

文献报道显示[13]，运动能促进软骨细胞合成，在细胞外基质平衡中发挥了重要作用，但是该结论尚未得到进一步证实。为了进一步证实不同运动强度在骨质疏松中的作用及对软骨形态的影响，课题中采用切断输卵管切除卵巢方法建立去势大鼠骨质疏松模型，并且对大鼠进行不同强度的运动锻炼。本研究中，中等强度组MMS评分低于低强度组、高强度组及模型对照组(P<0.05)；低强度组MMS评分低于高强度组及模型组(P<0.05)。提示中等强度运动能有效改善骨质疏松大鼠症状，改善机体软骨形态。中等强度运动在力学刺激作用在软骨后能提高软骨细胞的生物合成活性，在力学作用下能引起软骨的形态结构、成分等发生明显的变化，使得软骨形成一定的力学适应性。软骨在正常生理状态下具备一定的自我修复能力，该能力在软骨损伤、修复中同时进行[14]。通过中等强度的运动锻炼能让关节软骨承受较大的负荷，从而能改善关节软骨的力学性能。文献报道显示[15]，中等强度运动能预防机体软骨退变，能有效维持软骨的正常形态，但是过量的运动或低强度运动容易加剧软骨退行性变。

钙、磷及MMP-3在骨质疏松的发生、发展中发挥了重要作用。本研究中，中等强度组血清钙、血清磷水平低于低强度组、高强度组及模型对照组(P<0.05)，提示适宜载荷运动有助于骨形成，能促进骨骼的矿化，能降低大鼠血中钙的浓度。MMP-3是软骨中的胶原酶，对于II型胶原有高度的降解活性，中等强度运动下能降低MMP-3水平，而高强度作用下容易对关节软骨产生负作用，能反映软骨形态。本研究中，O番红染色显示模型对照组软骨表面光滑，呈圆形或椭圆形；低强度组大鼠人软骨表面相对光滑，细胞数量相对较多，排列规则，染色加深；中载荷运动组软骨表面光滑，染色明显增粗，基质染色较深，染色均匀；高强度组潮线不规则，染色相对较浅。由此看出，运动能造成软骨产生适应性改变，使得软骨厚度得到进一步增加，从而能提高软骨的损伤阈值，有助于软骨健康，提示不同强度运动对于大鼠的软骨形态不同。但是高强度运动不利于软骨生存，过量的运动超过了力学负荷超出了关节软骨的损伤阈值，从而打破了软骨内的稳态，导致软骨细胞代谢发生异常。因此，骨质疏松大鼠运动时必须把握好运动强度，具有双向性，过量的运动容易增加软骨损伤，中等强度运动效果最佳，能提高骨质疏松治疗效果，促进软骨增生。

综上所述，不同运动强度在去势大鼠骨质疏松中效果不尽相同，低强度运动下对膝关节软骨影响较小，高运动强度下容易造成软骨退行性改变，而中等强度运动能维持骨关节软骨形态，在骨质疏松预防和治疗中效果理想。