绝经后血清BMP-7、OCN水平与骨质疏松的相关性研究

余丽金 温广宇* 崔红旺

1. 海南现代妇女儿童医院，海南 海口 57000 2. 海南医学院第一附属医院，海南 海口 57000

骨质疏松(osteoporosis，OP)是绝经后女性发生较多的一种全身性骨病，以骨量减少及骨组织微结构病变为临床特征，可增加骨骼脆性，易引发骨折，严重影响患者生活质量[1]。OP发病机制尚未完全阐明，但已有研究表明，其发病与骨代谢异常有关。研究显示，骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)是作为骨形态发生蛋白家族的成员，可募集人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，hMSC)至骨折部位，改变hMSC迁移、侵袭能力，其具有治疗骨质疏松性骨折的潜力[2]。另外，骨钙素(osteocalcin，OCN)是非胶原酸性糖蛋白之一，在骨钙代谢中发挥重要作用，其在卵巢低反应患者中呈低水平，采用温阳补肾法结合运动指导可有效提高OCN，减少患者发生OP的风险[3]。但BMP-7、OCN在OP患者血清中的水平与患者骨代谢指标及骨密度的关系研究鲜少。本研究旨在分析绝经后OP患者BMP-7、OCN水平与骨代谢有关指标及骨密度的相关性，从而为临床防治OP提供一定参考依据。

1 材料和方法

1.1 临床资料

选取2017年5月至2019年3月于本院诊治的绝经女性OP患者93例为OP组，其中年龄50～70岁；身体质量指数(body mass index，BMI)为(18.69～26.15) kg/m2，绝经时间3～15年，所有患者符合《中国人骨质疏松症诊断标准专家共识》[4]有关OP判定标准。OP患者纳入标准：①患者均进行骨密度(bone mineral density，BMD)检查确诊；②自愿参与本项研究者。排除标准：①合并类风湿关节炎、骨肿瘤、甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能亢进等疾病者；②合并肝、肾、心血管系统、血液系统等严重疾病者；③一年内进行卵巢摘除、发生骨折者；④合并雌激素依赖性肿瘤者；⑤近期服用过钙制剂、肝素、雌激素、维生素D等影响骨代谢的药物者。并以同期来我院进行体检健康的绝经女性86例为对照组，其中年龄49～68岁，BMI为(18.73～26.34)kg/m2，绝经时间3～14年。

所有受试者或其家属签署知情同意书，所用研究方法符合伦理学要求，且经本院伦理委员会审核、批准。

1.2 主要试剂与仪器

TRIzol Reagent(货号：S30876)购买于上海源叶生物科技有限公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(货号：69001-3)购买于上海子起生物科技有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix(货号：JK-R2010)购买于上海晶抗生物工程有限公司；人骨特异性碱性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase，BAP)酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购买于美国METRI生物系统公司；人I型胶原交联氨基末端肽(type I collagen cross-linked opeptide，NTX)ELISA试剂盒购买于Ostex International 公司。

紫外分光光度计(型号：DU-730)购买于上海普迪生物技术有限公司；ABI 7500Fast 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)仪(型号：StepOne TM)购买于美国应用生物系统公司(上海)；双能X线骨密度仪(型号：Prodigy型)购买于通用电气医疗系统贸易发展(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1样本采集与预处理：收集两组受试者清晨空腹肘静脉血5～6 mL，自然凝集，3 600 r/min离心8 min，收集上层血清，分装，于-80 ℃冰箱中保存，待检。

1.3.2qRT-PCR法检测血清BMP-7、OCN表达水平：将血清样本从-80 ℃冰箱中取出，冻融，参考TRIzol试剂盒说明书抽提总RNA，检测其浓度、纯度及完整性。依据Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书配制反应体系，将RNA反转录成cDNA。最后，参照扩增反应试剂盒2x SYBR Green qPCR Master Mix说明书配制反应体系，在一定条件下进行扩增和检测。BMP-7、OCN以GAPDH为内参，以2-ΔΔCT计算两者表达水平，其相应引物序列如表1。

表1 BAP、NTX及内参GAPDH的引物序列Table 1 Primer sequences of BAP, NTX, and GAPDH

1.3.3ELISA法检测血清BAP、NTX水平：取出冻存血清样本，解冻，严格按照BAP、NTX ELISA试剂盒说明书检测两组受试者血清BAP、NTX水平。

1.3.4骨密度检测：受试者侧卧于检查床，使其脊柱与扫描检查床平行屈髋屈膝，腰椎平靠侧位定位器，受试者右拳放于床面，右臂与肩部垂直，与检查床呈90°，利用双能X线骨密度仪检测腰椎(L2-L4)、股骨颈、Ward三角区及大转子的BMD，取其平均值即为受试者个体BMD。参考文献[5]，仪器检测骨密度精度<1%变异系数，X射线管最大管电压76 kV。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 两组一般资料比较

与对照组相比，OP组患者雌二醇水平明显降低(P<0.05)，年龄、BMI、绝经时间差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 两组一般资料比较Table 2 Comparison of general data between the two groups

2.2 两组血清BMP-7、OCN、骨代谢指标、BMD水平比较

与对照组相比，OP组患者血清BMP-7、OCN、BAP/NTX、BMD表达水平明显降低(P<0.05)，OP组患者BAP、NTX水平明显升高(P<0.05)。详见表3。

表3 两组血清BMP-7、OCN、骨代谢指标、BMD水平比较Table 3 Comparison of serum BMP-7, OCN, bone metabolism index, and BMD between the two groups

2.3 OP患者血清BMP-7、OCN表达水平与骨代谢相关指标及BMD的相关性

Pearson法分析显示，OP患者血清BMP-7表达水平与BAP、NTX均呈负相关(P<0.05)，与BAP/NTX、BMD均呈正相关(P<0.05)；OP患者血清OCN表达水平与BAP、NTX均呈负相关(P<0.05)，

与BAP/NTX、BMD均呈正相关(P<0.05)。详见表4。

2.4 OP患者血清BMP-7表达水平与OCN的关系

Pearson法分析显示，OP患者血清BMP-7表达水平与OCN水平呈正相关(r=0.531，P<0.05)。详见图1。

表4 OP患者血清BMP-7、OCN表达水平与骨代谢指标、BMD的相关性

图1 OP患者血清BMP-7表达水平与OCN的关系Fig.1 The relationship between the level of serum BMP-7 expression and OCN in OP patients

2.5 影响OP的Logistic回归分析

以雌二醇、BAP、NTX、BAP/NTX、BMD为自变量，以是否发生OP为因变量，行Logistic回归分析，结果显示，雌二醇、BMD是影响OP发生的保护险因素(P<0.05)，BAP、NTX是影响OP发生的危险因素(P<0.05)。详见表5。

表5 Logistic回归分析OP的影响因素

3 讨论

绝经后OP是临床常见的由内分泌、遗传、物理等多种因素所致的一种代谢性骨病，其致残率、致死率均高，对女性生命安全及健康构成极度威胁[6]。因此，寻找可早期诊治评估OP的有效指标，并动态监测指标水平，对改善生存质量具有积极意义。

BMP-7是广泛分布于血液、骨膜、骨胶原纤维、骨髓基质中的转化生长因子β超家族成员，在骨和软骨细胞分化，骨和软骨的形成、发育、缺损修复等生物学过程中具有重要调控作用[7-8]。Schwarting等[9]通过研究发现仅在BMP-7刺激的牛腱标本、原代成骨细胞、成纤维细胞等培养物中出现组织的骨化区和碳酸钙样结构，BMP-7对体外肌腱-骨整合的生物学过程具有积极作用，其对治疗韧带损伤具有潜在的辅助价值。另有研究显示，BMP-7在骨折患者血清中表达异常，经丹参注射液治疗后，其水平表达上调，BMP-7可促进骨间充质干细胞向成软骨细胞、成骨细胞分化，促使钙盐沉积，形成新骨，其可能参与并影响骨折愈合过程[10]。以上研究表明，BMP异常表达可能与骨形成、代谢、修复等关系密切。本研究中OP组患者血清BMP-7表达下调，提示BMP-7可能在OP发展进程中发挥一定作用。猜测绝经后女性卵巢功能减退、雌激素显著减少，雌激素可能影响BMP-7表达，BMP-7进而影响成骨细胞的分化及活性，从而在OP过程中起一定作用。雌激素如何影响BMP-7表达的机制有待进一步研究。

OCN主要是由骨细胞分泌的一种维生素K依赖性钙结合蛋白，与成骨活性密切相关，在骨钙代谢中起重要作用，可一定程度反映骨形成、骨转化的程度，其对诊断钙代谢异常、OP等疾病具有重要价值[11-12]。相关研究显示OCN在原发性OP女性患者血清中呈异常表达，与BMD具有一定相关性，其水平有利于诊断绝经后OP[13]。另有研究指出，OCN在老年OP患者血清中呈低水平，经唑来膦酸治疗后，其水平显著上升，OCN可能在老年OP发生发展进程中发挥一定作用[14]。以上研究证实，表达异常的OCN可能与各种OP骨代谢疾病有关。本研究中OP组患者血清OCN表达水平明显降低，与俞菁等[14]研究趋势相符，提示OCN可能参与并影响OP发生发展过程。推测OCN可能降低骨细胞的活性，影响骨形成及骨吸收的平衡，进而影响OP发病过程。

在正常骨代谢中，成骨细胞形成新骨与破骨细胞吸收旧骨构成动态平衡，进行骨重建，一旦骨吸收超过骨形成，会引起OP。BAP是一种位于成骨细胞表面的特异性糖蛋白，可反映成骨细胞的活性，是具有较好诊断效能的骨形成指标，而NTX是骨I型胶原特异性降解的低分子肽，是较好的骨吸收生物标志物[15-16]，两者比值可助于鉴别个体是否易患OP及是否存在快速骨量丢失。本研究显示，OP组患者BAP、NTX水平明显升高，BAP/NTX比值明显降低，提示BAP、NTX均可能参与绝经女性OP疾病的发展，且OP疾病以NTX代表的骨吸收占主要优势，两者水平检测有助于判定是否发生OP及病情评估。国内外研究认为，OP患者BMD水平明显低于正常人，BMD是判定OP发生的常用指标。本研究显示，BMD在OP患者中水平明显降低，与前人研究[17]一致，提示BMD水平有助于评估OP病情进展程度。

本研究通过分析OP患者血清BMP-7、OCN水平与骨代谢及BMD指标的相关性，结果显示，BMP-7、OCN表达水平均与BAP、NTX呈负相关，与BAP/NTX、BMD呈正相关，提示BMP-7、OCN可能与BAP、NTX、BMD相互作用，协同影响OP发生、发展。进一步研究显示BMP-7在OP患者血清中的表达水平与OCN呈正相关，提示，两者可能相互影响，从而共同在OP发展过程中起作用。此外，研究显示雌二醇、BMD是影响OP发生的保护险因素，BAP、NTX是影响OP发生的危险因素，提示雌二醇、BMD水平降低，BAP、NTX升高均有可能增加OP发生风险，及时监控雌二醇、BMD、BAP、NTX水平有助于及早防治OP。

综上所述，BMP-7、OCN在OP患者血清中呈低表达，两者与骨代谢指标BAP、NTX及BMD具有一定相关性，两者可能在OP患者的骨代谢中发挥作用。但本研究取样较少，可能会导致结果出现一定程度偏差，后期将加大样本量进行更深入的探究。